Biomaterials：投影式光固化3D打印仿生皮膚

來源： EngineeringForLife

由于日益增長的老齡化人口不斷推動需求的增長,，在當今臨床實踐中,，容易移植的供體組織和器官的短缺仍然是一個重大問題,。組織工程(通常由支架,、細胞和生長因子組成)已成為修復受損組織的一種有前途的替代方法,。對于現(xiàn)有的生物打印技術來說,，制作適合植入的器官仍然是一個挑戰(zhàn)，主要原因是無法再現(xiàn)器官復雜的解剖結構,、機械性能和生物功能,。此外，無法制造具有營養(yǎng)輸送功能的微通道結構,，也限制了3D打印技術的臨床應用,。

作為人體最大、增長最快的器官,，皮膚在保護身體免受外部損傷方面起著至關重要的作用,。由于自我修復能力有限，三度燒傷和真皮全層缺損等創(chuàng)傷性傷口是最難愈合的傷口;因此,，需要供體皮膚或生物工程人類皮膚構建體(HSCs)來輔助再生過程,。然而，由于供體皮膚的缺乏,、長期生存能力差以及缺少造血干細胞的附屬物來,，皮膚再生仍然是一個嚴峻的挑戰(zhàn)。為此浙江大學的章淑芳副教授和歐陽宏偉教授課題組利用光固化3D打印技術,，使用新設計的GelMA/ HA-NB/LAP生物墨水,，打印了具有仿生結構的仿生皮膚。仿生皮膚中相互貫通的孔道可以促進營養(yǎng)物進入和氧氣的交換,，有利于細胞黏附,，遷移和增殖與新生組織形成,，相應研究成果發(fā)表于期刊Biomaterials上。

研究人員采用GelMA/HA-NB/LAP作為材料,，一方面原因在于其快速凝膠化特性,，并且與天然ECM的結構相似，這可以為細胞的生長和組織再生提供有益的微環(huán)境,。同時,，在紫外光的作用下，凝膠鏈上的醛基與胺基發(fā)生反應,，HA-NB可以很容易地調(diào)節(jié)凝膠的力學性能,，如Figure1。此外,，GelMA/HA-NB/LAP水凝膠還可作為一種粘合劑,，在體內(nèi)植入時起到固定作用。在打印方法上,，相較其他生物3D打印方法,，基于投影式光固化的3D打印技術具有更高的打印速度、微尺度分辨率和更高的細胞存活率,，在打印復雜器官結構方面取得了突破,。

圖1 快速光固化生物墨水與投影式光固化打印

皮膚通常分為兩層：致密的上層(表皮)和疏松的下層(真皮層)。為此研究人員設計了相應的仿生結構,，上層(500μm)致密,，有利于保護傷口免受外部機械沖擊和壓力。底層(1.5 mm)為懸臂梁多孔結構結構,，可促進細胞遷移和氧/營養(yǎng)交換,，從而促進血管生成，如Figure2,。為確定最佳的孔徑尺寸,，研究人員設計并打印了不同的微通道尺寸(200μm、300μm,、400μm),。在經(jīng)過力學測試后，最終選擇了微通道尺寸為200μm的支架進行進一步的研究以修復皮膚缺損,，而無微通道的支架作為對照。

圖2 3D打印復雜的雙層凝膠仿生皮膚結構

為了評估基于投影式光固化的3D打印功能性皮膚的生物相容性,，將HSFs和HUVECs分別混合入生物墨水并打印成無微通道和有微通道的支架,。這些結果表明細胞存活率高(>95%)，支持細胞生長和增殖,，水凝膠生物墨水具有良好的生物相容性,，在構建三維組織方面具有廣闊的前景,，如Figure3（A-F）。然后,，研究人員使用TIANamp基因組DNA試劑盒檢測結構中不同層中HSFs和HUVECs的總DNA,。第5天HUVECs的DNA含量幾乎比第1天高出2倍，HSFs在第5天的DNA含量比第1天高出近3倍,，說明生物墨水支持HUVECs和HSFs的生長和增殖,。功能化的活體器官需要維持其固有的結構，以支持細胞的生長和增殖,。在第5天的熒光通道下觀察到較低層的結構被很好地區(qū)分出來,，這表明整個結構沒有失去其原有的設計，如Figure3G,。

圖3 仿生皮膚的細胞相容性,、細胞增殖和結構可持續(xù)性

為觀察仿生皮膚內(nèi)的細胞遷移，研究人員將標記的HSFs與HUVECs混于生物墨水中,，并進行分區(qū)域打印,，如Figure4。標記的細胞從最初的界限分明到5天后的互相滲透,，結果證明相互連通的微通道結構可以促進氧/營養(yǎng)灌注和誘導組織形成,，從而促進細胞吸附和遷移。

圖4 仿生皮膚內(nèi)的內(nèi)細胞遷移分析

此外,，支架還必須支持宿主細胞的粘附,、遷移和增殖，以刺激新組織的形成,。為了評估這一特性,，將HSFs和HUVECs作為宿主細胞接種在支架表面(無微通道)和仿生皮膚（含微通道）上，如Figure5,。結果表明,，該生物墨水具有良好的生物相容性，能夠促進細胞的增殖和遷移,，有可能在體內(nèi)吸引其他宿主細胞,，促進新組織的形成。

圖5 仿生皮膚外細胞遷移和粘附分析

研究人員使用大鼠和豬進行了全層皮膚缺損模型實驗,，用以評估仿生皮膚的體內(nèi)治療效果,。手術過程示意圖如Figure6所示，在背部表面創(chuàng)建一個缺損,，然后將3D打印的仿生皮膚植入缺損處,。為了將仿生皮膚牢固固定在缺損處，在所有縫隙處注入GelMA/HA-NB/LAP水凝膠,，通過UV光交聯(lián)的GelMA/HA-NB/LAP水凝膠也可作為生物膠,。對照組大鼠出現(xiàn)抓撓行為,，而仿生皮膚植入組和正常組大鼠未出現(xiàn)防御反應(無抓撓反應)。因此,，這些結果表明,，植入的仿生皮膚，成功地在機體表面起到了類似于自然皮膚的保護屏障作用,。并且在炎癥反應實驗中,，仿生皮膚與其他組相比，幾乎沒有或幾乎沒有炎癥跡象,。表明仿生皮膚在不激活先天炎癥反應的情況下,，能夠提供理想的傷口愈合環(huán)境。在血管化實驗中,，它也能夠加速傷口愈合過程中的新血管形成,，并促進皮膚附件的真皮再生。

圖6 仿生皮膚用于大鼠全層皮膚缺損修復

而臨床相關大型動物模型的實驗中表明,，與對照組相比,，仿生皮膚組的傷口愈合速度明顯更快，如Figure7,。H&E染色還顯示,，僅在仿生皮膚組有皮脂腺和毛囊形成，而對照組幾乎沒有形成皮脂腺和毛囊,。此外,，仿生皮膚組的再生皮膚結構與天然皮膚的健康結構非常相似(包括毛囊，血管,，皮脂腺),。從TEM圖像可以看出，與正常組相似,，與對照組相比,，仿生皮膚組的膠原纖維排列整齊緊密。

圖7 仿生皮膚用于豬全層皮膚缺損修復

本研究表明,，利用基于投影式光固化的3D打印技術結合仿生生物墨水和功能細胞制作仿生皮膚具有良好的可行性,。仿生皮膚中相互連接的微通道有利于充分的營養(yǎng)交換，在促進細胞和新形成組織之間的相互作用中發(fā)揮了重要作用,。且仿生水凝膠生物墨水所提供的微環(huán)境能最大限度地促進細胞遷移和增殖,。體內(nèi)研究表明，無論在小型動物還是大型動物中,，仿生皮膚都能促進皮膚的傷口愈合,，在皮膚附屬物(如毛囊)的再生方面也表現(xiàn)出了優(yōu)越的性能。

總之,，基于投影式光固化的3D打印,、仿生水凝膠生物墨水和功能細胞的獨特結合，為快速,、大量生產(chǎn)生物活性器官提供了有效途徑,，可以創(chuàng)造出更多的定制化和功能化的活體器官，并應用于組織工程研究,。

論文鏈接：
https://doi.org/10.1016/j.biomaterials.2020.120287