中山大學(xué)郭雙壯等《Adv.Sci.》:冰與光之歌,，冷凍打印+激光融化實(shí)現(xiàn)大尺寸細(xì)胞凍存！

來源： 高分子科學(xué)前沿

干細(xì)胞療法可以為癌癥,、帕金森病,、受損脊柱神經(jīng)、糖尿病等諸多疾病的治療帶來革命性的改變,，但其中關(guān)鍵的一步是細(xì)胞制品的高通量冷凍保存,，并在使用前快速高效復(fù)蘇。而傳統(tǒng)較慢的冷凍方法會引起細(xì)胞內(nèi)外水的結(jié)晶,，從而對細(xì)胞器和遺傳物質(zhì)帶來無法修復(fù)的損傷,。這就需要添加較多的冷凍保護(hù)劑（CPA）或保存小尺寸的樣品來提高細(xì)胞存活率。同時,，傳統(tǒng)的水浴復(fù)蘇法在處理大尺寸干細(xì)胞凍存樣品時也會因傳熱緩慢而損傷細(xì)胞,。因此，如何高通量,、高存活率地凍存和復(fù)蘇干細(xì)胞成為制約相關(guān)制品應(yīng)用的瓶頸之一,。

中山大學(xué)的郭雙壯副教授和美國明尼蘇達(dá)大學(xué)John Bischof教授團(tuán)隊合作，開發(fā)了液氮溫度下的大液滴冷凍打印技術(shù)和激光引發(fā)的等離體激元加熱融化技術(shù),，并分別應(yīng)用于大尺寸干細(xì)胞樣品的凍存和復(fù)蘇,，整個過程細(xì)胞存活率高達(dá)90%以上。該研究內(nèi)容以 "Conduction Cooling and Plasmonic Heating Dramatically Increase Droplet Vitrification Volumes for Cell Cryopreservation" 為題發(fā)表在《Advanced Science》上,。

圖 1. 大液滴玻璃化冷凍打印和激光解凍示意圖

大尺寸液滴冷凍打印
計算機(jī)控制的3D打印墨水分配系統(tǒng),，可以通過調(diào)節(jié)壓力和時間很靈活地控制液滴的大小和位置，為自動化高通量冷凍保存提供了支持,。液滴冷凍打印的目標(biāo)是使液滴盡可能快速地從室溫冷卻到零下140 ℃以下,，水分子來不及結(jié)晶而以玻璃態(tài)保存,，這就需要在CPA盡量少用的情況下提高液氮和液滴之間的熱量傳遞速度。直接將液滴打印到液氮中會因?yàn)榈獨(dú)獾陌�裹浮在液��,，同時氮?dú)鈱右沧璧K了液滴中熱量的傳遞,，降低了冷卻速度而使水結(jié)晶成冰。

作者采用浮在液氮表面的銅箔作為載體,，在液氮沸點(diǎn)溫度（-196 ℃）附近的環(huán)境中將液滴打印在銅箔表面（如圖1所示）,。這種方法一方面使得液滴以較大接觸面與銅箔以熱傳導(dǎo)方式發(fā)生快速熱量交換，同時表面與超冷空氣以自然對流方式傳熱,，二者共同作用下液滴的冷卻速率高達(dá) 104 ℃/min （如圖2所示）,。 隨著液滴體積的變大，頂部冷卻速率迅速下降,，同時內(nèi)部熱應(yīng)力的積累還會導(dǎo)致液滴的破碎,，綜合CPA濃度和冷卻速度等因素的影響，4微升液滴具有較為平衡的玻璃化能力,。

圖 2. 液滴冷卻速率表征,。A-C）在打印液滴的頂部、中部和底部放置熱電偶用于測量溫度實(shí)時變化（比例尺=1 mm）,。D） 不同位置的溫度變化曲線,。E）不同位置平均冷卻速率。

激光等離體激元加熱
除了快速冷凍,，加熱復(fù)蘇也是細(xì)胞制品凍存過程的重要環(huán)節(jié),，而傳統(tǒng)水浴復(fù)蘇法是一種對流熱傳遞過程，在升溫后期會存在明顯的去玻璃化現(xiàn)象,，同時隨著液滴體積的增大,，內(nèi)部升溫速率會迅速減小到103 ℃/min。本研究中,，在CPA溶液加入生物相容性良好的金納米棒（GNR），在波長為1064 nm激光作用下通過等離子體激元效應(yīng)將光能轉(zhuǎn)化為熱能,，再將熱能迅速傳遞到周圍處于玻璃態(tài)的液滴并使其融化（如圖3所示）,。

通過精確調(diào)節(jié)GNR濃度、激光強(qiáng)度和脈沖時間,，可以避免液滴在加熱過程中出現(xiàn)過冷或過熱現(xiàn)象對細(xì)胞的損害,。這樣通過無數(shù)納米顆粒多點(diǎn)加熱的方式可以使得凍存的玻璃態(tài)液滴以高達(dá) 106 ℃/min的升溫速率被復(fù)蘇。同時隨著液滴體積的增大,，由于透鏡折射作用而引發(fā)的分層現(xiàn)象更加明顯（圖3G）,。外層液滴無法經(jīng)激光直接加熱，需要經(jīng)內(nèi)部液滴熱傳導(dǎo)加熱而融化,，從而形成一個較冷的外殼,。對于超過16 微升的液滴來說,，由于外殼較厚會發(fā)生重新結(jié)冰現(xiàn)象，對細(xì)胞的存活產(chǎn)生較大影響,。經(jīng)過系列過程參數(shù)優(yōu)化,，含有干細(xì)胞的4微升液滴經(jīng)過冷凍打印-激光復(fù)蘇整個流程處理之后，干細(xì)胞的存活率可達(dá)90.4%,。冷凍的液滴在液氮中保存三個月再重新經(jīng)激光復(fù)蘇,，細(xì)胞存活率沒有明顯下降。

綜上所述,，作者及研究團(tuán)隊將冷凍打印和激光加熱相結(jié)合,，可以獲得超高的冷卻和升溫速率，從而實(shí)現(xiàn)大液滴（4微升）,、低CPA濃度,、高存活率地凍存干細(xì)胞。整個過程都可以進(jìn)一步由自動化程序控制,，從而為高通量,、高效率凍存生物制品提供了一條可靠的技術(shù)路徑。未來該技術(shù)可適用于其他細(xì)胞類型,，為血液病,、癌癥患者等需要進(jìn)行細(xì)胞治療的人群帶來福音。

圖 3. 玻璃化液滴加熱復(fù)蘇過程表征,。A）高速相機(jī)記錄的激光加熱過程,。B）傳統(tǒng)水浴加熱過程。C）等離子激元加熱原理示意圖,。D-E）GNR濃度對溫度非均一性,、能量吸收率的影響。F）不同液滴大小和GNR濃度與能量吸收率之間的關(guān)系,。G）不同大小液滴在激光加熱過程中的照片和升溫速率分布模擬結(jié)果,。H）不同液滴大小在激光加熱和水浴加熱過程中的升溫速率變化。I）不同液滴內(nèi)部超過臨界升溫速率體積分布,。比例尺=1 mm,。

占利博士和郭雙壯副教授為該論文的第一作者，John Bischof教授為該論文的通訊作者,。

原文鏈接：https://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/advs.202004605