基于微流控制備載細(xì)胞核-殼結(jié)構(gòu)微凝膠的3D打印骨再生結(jié)構(gòu)的構(gòu)建

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利用3D生物打印技術(shù)制備載細(xì)胞組織結(jié)構(gòu)時(shí),，打印過(guò)程中的剪切應(yīng)力顯著降低了生物活性,。已有研究證明,，具有獨(dú)立控制隔室的微凝膠可以在打印過(guò)程中保護(hù)細(xì)胞。

近期,，東華大學(xué)化學(xué)化工與生物工程學(xué)院和材料科學(xué)與工程學(xué)院的何創(chuàng)龍教授團(tuán)隊(duì)和周小軍老師聯(lián)合復(fù)旦大學(xué)附屬浦東醫(yī)院骨科的何家文醫(yī)生提出利用基于微流控技術(shù)制備的核-殼結(jié)構(gòu)的微凝膠封裝細(xì)胞,，以減少擠出生物3D打印過(guò)程中剪切應(yīng)力對(duì)細(xì)胞的損傷，并在骨組織修復(fù)領(lǐng)域具有良好的應(yīng)用前景,。相關(guān)論文“Construction of 3D printed constructs based on microfluidic microgel forbone regeneration”發(fā)表于雜志Composites Part B上,。

圖1 載細(xì)胞微凝膠和 3D 打印載細(xì)胞微凝膠的制造過(guò)程示意圖

1. 微流控制備核-殼結(jié)構(gòu)的載細(xì)胞微凝膠

參數(shù)
油相：含有1v/v%司班80、0.01v/v%乙酸和0.8w/v% CaCl2-NP的液體石蠟
殼：2%w/v的海藻酸鈉和50 mM Ca-EDTA混合溶液
核：含有GFP-BMSCs cells/mL的I型膠原溶液
流速：水相Qaqu /油相Qoil = 1/3,，核相 Q1/殼相Q2 = 2

微凝膠制備過(guò)程（圖1）
將核心溶液和殼溶液分別裝入無(wú)菌微流控注射器的中間和兩側(cè)的注射器中,，流速由注射泵獨(dú)立控制,，在微流體平臺(tái)上制備載有細(xì)胞的微凝膠；然后,，在收集過(guò)程中,，使用PBS溶液（pH = 7.4）中和油相中的乙酸溶液；最后,，將載有細(xì)胞的微凝膠重新懸浮在細(xì)胞培養(yǎng)基中進(jìn)行體外培養(yǎng),。


表征
乙酸和 CaCl2 -NP濃度與微凝膠形態(tài)的關(guān)系：當(dāng) CaCl2-NP的濃度為0.8wt % 時(shí)，0.01 v/v%的乙酸溶液即可形成粒徑均勻的微凝膠（圖2）,。

流速與微凝膠的粒徑分散性和殼核結(jié)構(gòu)的關(guān)系：粒徑分散性隨著流速比Qaqu/Qoil的減小而減小,，尺寸也相應(yīng)減小（圖2）,；I型膠原相 (Q 1 )流速增加,，核層厚度增加，殼層厚度相應(yīng)減�,。▓D3）,。
醋酸濃度和Qaqu/Qoil的流速比對(duì)載細(xì)胞微凝膠細(xì)胞活力的影響（圖4）：隨著乙酸濃度的降低和流速比的增加，細(xì)胞活力相應(yīng)增加,；使用這些參數(shù)制備的微凝膠具有良好的生物相容性,。

圖2 乙酸、CaCl2 -NP濃度和流速對(duì)微凝膠形態(tài)的關(guān)系圖

圖3 流速與微凝膠殼-核的關(guān)系圖

圖4 載細(xì)胞微凝膠中細(xì)胞活力圖

2. 3D載微凝膠結(jié)構(gòu)的生物打印
打印參數(shù)
噴嘴內(nèi)徑為500 μm,；
層高0.55mm,，網(wǎng)格填充寬度1mm，軸速度3mm/s,，氣壓值0.25 MPa,；
墨水預(yù)處理溫度4℃。


打印過(guò)程
將生物3D打印機(jī)放置在無(wú)菌室中,，以確保打印過(guò)程的無(wú)菌性,。2 mL載細(xì)胞微凝膠（5×10^5個(gè)細(xì)胞）與SilMA/GelMA 復(fù)合材料混合作為3D生物打印的生物墨水。為確保細(xì)胞數(shù)的一致性,，將2 mL培養(yǎng)基（5×10^5個(gè)細(xì)胞）加入到不含微凝膠的bioink中作為對(duì)照組進(jìn)行生物打印,。3D打印體在UV照下（365nm，10秒）進(jìn)行光交聯(lián),，并轉(zhuǎn)移到細(xì)胞培養(yǎng)板培養(yǎng),。


表征：
微凝膠結(jié)構(gòu)對(duì)細(xì)胞活力的影響：3D打印的載細(xì)胞微凝膠結(jié)構(gòu)的細(xì)胞活力高于載細(xì)胞3D打印結(jié)構(gòu)，微凝膠在打印過(guò)程中對(duì)細(xì)胞的保護(hù)作用,。

圖5 3D打印結(jié)構(gòu)體的細(xì)胞增殖圖

3. 3D打印結(jié)構(gòu)促進(jìn)骨組織再生
炎癥反應(yīng)：將Microgel-15%SilMA/GelMA和15%SilMA/GelMA 構(gòu)建體置于 SD 大鼠的皮下,，材料與組織界面周?chē)�未觀(guān)察到明顯的炎癥反應(yīng)，適合體內(nèi)植入,。

骨缺損修復(fù)效果：將載有細(xì)胞的構(gòu)建體置SD大鼠的顱骨缺損處,，micro-CT,、BMD及H&E 染色結(jié)果表明Microgel-15%SilMA/GelMA比15%SilMA/GelMA相比，可明顯促進(jìn)BMSCs的增殖和體內(nèi)骨再生,。

圖6 皮下植入3D 打印結(jié)構(gòu)體1周和2周后的H&E 和 Masson 染色

圖7 評(píng)估體內(nèi)骨再生圖

總之,，研究者證明了使用微凝膠封裝細(xì)胞減少打印過(guò)程中的細(xì)胞損傷、增強(qiáng)細(xì)胞活力策略的可行性,。同時(shí)表明,，嵌入微凝膠的SilMA/GelMA具有良好的生物相容性，具有成為用于3D 生物打印的多功能生物墨水的潛力,。

參考文獻(xiàn)

Ningwen Chai,，Jingtian Zhang，Qianqian Zhang ,，Haibo Du,，Xi He，Jin Yang,，Xiaojun Zhou,，Jiawen He，Chuanglong He. Construction of 3D printed constructs based on microfluidic microgel for bone regeneration. Composites Part B
https://doi.org/10.1016/j.compositesb.2021.109100