干貨： 全球細(xì)胞3D打印技術(shù)綜述

南極熊導(dǎo)讀：本文是由一個(gè)生物3D打印領(lǐng)域的博士所寫(xiě)的干貨文章，對(duì)全球的細(xì)胞3D打印技術(shù)進(jìn)行了綜述，已于2019年1月發(fā)布在《新材料產(chǎn)業(yè)》上。
作者：趙  雨     上普博源(北京)生物科技有限公司

目前，英國(guó)有 5 000多人在等待移植新的腎臟。在接下來(lái)的一年里，經(jīng)過(guò) 平均大約 30個(gè)月的等待后，他們中只 有不到一半的人會(huì)得到新的腎臟。其 余的人將繼續(xù)等待，可他們不能永遠(yuǎn) 堅(jiān)持下去:2016年，457名英國(guó)人在等 待新腎、新肝、新心臟或新肺的過(guò)程中 死亡。另有 875人由于已經(jīng)病得無(wú)法 接受移植手術(shù)而從候補(bǔ)名單上被除 名。而在中國(guó)這種情況更為嚴(yán)重，據(jù) 統(tǒng)計(jì)，中國(guó)的人體器官的供需比僅為 1∶ 30，與英美發(fā)達(dá)國(guó)家的 1∶ 3左右 的供需比相差甚遠(yuǎn)。在數(shù)以萬(wàn)計(jì)的等 待者中，每年僅有幾千名幸運(yùn)兒可以 接受器官移植。

南極熊配圖：艾伯爾生物3D打印技術(shù)

1 生物3D打印技術(shù)簡(jiǎn)介
如果科學(xué)家們不再依賴(lài)稀缺的捐 贈(zèng)器官，而是能夠在實(shí)驗(yàn)室中快速、廉 價(jià)地構(gòu)建健康的新器官，并將患者自 身的細(xì)胞作為原材料，那會(huì)怎樣?在 過(guò)去的約 15年里，這個(gè)夢(mèng)想推動(dòng)了在 生物 3D打印領(lǐng)域的投資和研究。生物 3D打印技術(shù)是將生物單元(細(xì)胞/蛋 白質(zhì)/ D N A等)和生物材料按仿生形 態(tài)學(xué)，生物結(jié)構(gòu)或生物體功能，細(xì)胞 特定微環(huán)境等要求用“三維打印”的技 術(shù)手段制造出具有個(gè)性化的體外三維 結(jié)構(gòu)模型或三維生物功能結(jié)構(gòu)體。其科學(xué)研究、技術(shù)應(yīng)用和產(chǎn)業(yè)化發(fā)展廣 涵于生物 3D打印裝備和生物墨水的 研發(fā)及制造、高端醫(yī)療器械的制造、復(fù) 雜組織工程支架制造、體外生物功能 結(jié)構(gòu)體的制造、生物/病理/藥理模型 和新藥檢測(cè)模型制造等。

生物 3D打印作為一門(mén)新興交叉 前沿技術(shù)領(lǐng)域，目前在國(guó)內(nèi)外得到前 所未有的戰(zhàn)略關(guān)注， 如美國(guó)增材生 物制造探討，歐盟《制造業(yè)的未來(lái) : 2015 ~2020戰(zhàn) 略 報(bào) 告》、“十 三 五”規(guī) 劃綱要、國(guó)家科學(xué)技術(shù)部/工業(yè)和信 息化部 3D打印戰(zhàn)略規(guī)劃等均將以細(xì) 胞和先進(jìn)生物材料為基礎(chǔ)的生物制造 和生物 3D打印技術(shù)視為國(guó)家重要戰(zhàn) 略發(fā)展方向。

2 生物 3D 打印技術(shù)的應(yīng)用
根據(jù)所用生物材料性能的不 同，清華大學(xué)生物 3D打印中心將目前 生物 3D打印技術(shù)分為 4個(gè)層次。
△南極熊配圖：細(xì)胞3D打印應(yīng)用，圖片來(lái)自上普博源

第 1層次是打印無(wú)生物相容性要求的材料，可應(yīng)用于 3D打印體外病例 模 型 、手 術(shù) 導(dǎo) 板 、3 D 打 印 體 外 假 肢 或 矯形輔具等領(lǐng)域，該層次的應(yīng)用極大 地發(fā)揮了 3D打印在個(gè)性化定制方面 的優(yōu)勢(shì)，幫助相關(guān)病人量身定做相關(guān) 手術(shù)模型或治療工具，可使病人得到 更好的治療。

第 2層次是打印具有生物相容 性，但非降解材料。此類(lèi)打印產(chǎn)品可以 作為體內(nèi)永久植入物，材料可以是鈦 合金等金屬等材料，也可以是高分子 等惰性材料等，其中 3D打印金屬植入 物廠商愛(ài)康醫(yī)療已獲得多個(gè)C F D A上 市許可證書(shū)，產(chǎn)品已應(yīng)用于臨床。

第 3層次是打印具有良好生物相 容性且可降解的生物材料，主要的應(yīng) 用領(lǐng)域?yàn)榇蛴〗M織工程支架。其要求 打印的體內(nèi)植入物不僅能與體內(nèi)相 容，還要具有降解特性，在體內(nèi)一定 時(shí)間促進(jìn)體內(nèi)缺損組織的生長(zhǎng)和愈 合。由清華大學(xué)生物制造中心獨(dú)創(chuàng)的 3D打印低溫沉積制造技術(shù)集成了生 物 3D打印與冷凍干燥微觀制孔技術(shù) 的優(yōu)勢(shì)，可實(shí)現(xiàn)同時(shí)具有宏觀可控孔 隙(百微米級(jí))與微觀微絲孔隙(十微 米級(jí))的組織工程支架的 3D打印，提 高了支架內(nèi)的細(xì)胞種植率，更利于細(xì) 胞在支架內(nèi)部的生長(zhǎng)和組織功能的實(shí) 現(xiàn)，并在骨組織工程支架等領(lǐng)域應(yīng)用 良好，并已開(kāi)始向臨床轉(zhuǎn)化。

第 4層次是打印活性細(xì)胞，蛋白 及其他生物活性分子等，該層次的生 物 3D打印技術(shù)也被稱(chēng)作細(xì)胞 3D打印 技術(shù)。細(xì)胞 3D打印技術(shù)可以直接將細(xì) 胞、蛋白及其他具有生物活性的材料(例如蛋白質(zhì)，D N A，生長(zhǎng)因子等)作為 3D打印的基本單元，以 3D打印的方式，直接構(gòu)建體外生物結(jié)構(gòu)體、組織 或器官模型。


△南極熊配圖



3 細(xì)胞3D打印的技術(shù)挑戰(zhàn)
細(xì)胞 3D打印技術(shù)是目前生物 3D 打印技術(shù)的最前沿技術(shù)，也是實(shí)現(xiàn)器 官打印的最大潛在技術(shù)。打印過(guò)程 中，細(xì)胞必將承受一定的機(jī)械力，甚至 造成一定損傷，因此，細(xì)胞 3D打印技術(shù)的實(shí)現(xiàn)充滿(mǎn)了各種技術(shù)挑戰(zhàn)，細(xì)胞3D打印的技術(shù)挑戰(zhàn)主要包括以下幾 個(gè)方面。

3.1 材料能否打印
首先要選擇能被生物 3D打印機(jī) 打印的生物材料/生物墨水，雖然不 同的打印工藝對(duì)生物墨水粘度有不 同要求，但總體來(lái)講，太低粘度或太 高粘度的生物墨水，都很難被打印。因 此，細(xì)胞 3D打印的第一個(gè)挑戰(zhàn)是要找 到可以被打印的生物墨水。
3.2 能否構(gòu)建3D結(jié)構(gòu)
并不是所有被打印的生物墨水都 可以構(gòu)建 3D結(jié)構(gòu)，為了打印出具有高 分辨率的 3D復(fù)雜細(xì)胞結(jié)構(gòu)體，細(xì)胞打 印墨水需滿(mǎn)足通過(guò)提高打印墨水的粘 度來(lái)提高生物墨水的凝膠能力，以維 持層層堆積結(jié)構(gòu)體的力學(xué)性能。

3.3 細(xì)胞能否存活
增加細(xì)胞打印墨水的粘度，會(huì)導(dǎo) 致打印過(guò)程中細(xì)胞打印墨水中的細(xì)胞所承受的剪切力增加，從而導(dǎo)致打印 后細(xì)胞存活率的下降。因此，控制好打 印過(guò)程中細(xì)胞打印墨水的粘度(既不 能太高也不能太低)，尋找細(xì)胞打印墨 水的合適粘彈性區(qū)間，是實(shí)現(xiàn)良好細(xì) 胞三維打印(良好的成形性能與生物 學(xué)性能)的重要步驟。

3.4 是否具有功能性
剛打印的 3D細(xì)胞結(jié)構(gòu)體，只是細(xì) 胞和生物材料的 3D組合體，并沒(méi)有形 成組織特征。因此，打印的 3D細(xì)胞結(jié) 構(gòu)體，必須經(jīng)過(guò)適宜的培養(yǎng)條件，才能 形成組織功能性。此環(huán)節(jié)需要保證，生 物材料的生物相容性，力學(xué)性能和功 能性，培養(yǎng)基的充足供應(yīng)和廢物的充 分排出等。甚至有些組織需要特定的 生物反應(yīng)器，通過(guò)流體，力或電的刺激 才能達(dá)到其功能性。

綜上所述，細(xì)胞 3D打印的各個(gè)環(huán) 節(jié)充滿(mǎn)了不同甚至具有一定相互矛盾 的技術(shù)挑戰(zhàn)，需要多學(xué)科的交叉背景 知識(shí)和多年的經(jīng)驗(yàn)積累去解決。

4 細(xì)胞 3D 打印技術(shù)分類(lèi)
其根據(jù)其離散細(xì)胞墨水的方法主要可以分為 5類(lèi)(表 1)。

4.1 噴墨式細(xì)胞打印技術(shù)
噴墨式細(xì)胞打印是基于普通噴 墨打印機(jī)的打印原理，利用熱氣泡或 壓電的體積變化，擠壓墨盒內(nèi)的細(xì)胞 墨水，離散產(chǎn)生含有細(xì)胞的細(xì)胞墨水的微滴并噴射出去。噴墨打印機(jī)的 噴嘴直徑僅有幾十微米，可以進(jìn)行高 精度的細(xì)胞打印，但是也由于其噴嘴 直徑比較小，噴墨式細(xì)胞打印難以離 散打印高粘度的細(xì)胞墨水，使得此技 術(shù)直接打印三維生物學(xué)實(shí)體模型較困 難 ;此外，熱氣泡的產(chǎn)生和壓電的變 形會(huì)對(duì)細(xì)胞造成一定損傷，需較好的 控制打印工藝參數(shù)。代表性研究機(jī)構(gòu) 有德州大學(xué)的Boland教授課題組。

4.2 微擠出式細(xì)胞三維打印技術(shù)
微擠出式細(xì)胞三維打印技術(shù)，利 用機(jī)械力或氣壓等驅(qū)動(dòng)力，直接通過(guò)微 噴頭連續(xù)擠出生物材料和細(xì)胞構(gòu)建三 維生物學(xué)結(jié)構(gòu)體。由于常用的微擠 出式細(xì)胞打印機(jī)的噴嘴直徑多在百微 米級(jí)，打印精度一般，但其擠出式的工 藝可以打印高粘彈性的生物墨水，易于 實(shí)現(xiàn)三維生物學(xué)實(shí)體的構(gòu)建。此外，此 技術(shù)在犧牲精度的同時(shí)，使得打印出的 每一個(gè)離散單元體積變大，間接地提高 了打印效率和細(xì)胞存活率。代表的研究 機(jī)構(gòu)有清華大學(xué)生物制造中心的孫偉 教 授 課 題 組 ，美 國(guó) 哈 佛 大 學(xué) 的 J e n n i f e r Lewis教授課題組。

4.3 激光直寫(xiě)式細(xì)胞打印技術(shù)
激光直寫(xiě)式細(xì)胞打印技術(shù)，是指 利用光壓力控制細(xì)胞排列成具有高 精度的空間結(jié)構(gòu)，其精度可達(dá)單細(xì)胞 量級(jí)，但提高的精度也導(dǎo)致成形效率 下降明顯，該工藝也難以打印粘度較高的生物材料，使得其打印三維生物 學(xué)結(jié)構(gòu)體的能力降低。代表的研究 機(jī)構(gòu)有美國(guó)明尼蘇達(dá)大學(xué)的David Odde教授課題組。

4.4 立體光刻細(xì)胞三維打印技術(shù)
立體光刻細(xì)胞三維打印技術(shù)，通過(guò) 激光或紫外光在空間的掃描運(yùn)動(dòng)實(shí)現(xiàn)對(duì) 含有細(xì)胞的光刻膠的立體固化成形，制 造出預(yù)設(shè)計(jì)的三維生物學(xué)結(jié)構(gòu)。雖 然 這種技術(shù)具有高度的柔性，但其成型 效率卻不如人意。部分開(kāi)發(fā)者不再利 用激光細(xì)小的光斑掃描立體固化成 形，而是利用投影機(jī)原理，進(jìn)行面投 射，每層同時(shí)固化成形。該工藝根據(jù)投 影機(jī)類(lèi)型主要可以分為液晶投影儀 型和數(shù)字微鏡(Digital Micromirror D e v i c e s , D M D )投 影 儀 型 ，兩 者 的 本 質(zhì)區(qū)別是液晶投影儀首先將光源分解 成 3種單色光，再分別通過(guò) 3個(gè)液晶片 控制 3種單色光的亮度，最終合成所 需的光和圖案，而D M D只是利用一個(gè) 可以反射光源的數(shù)字陣列式微鏡來(lái)實(shí) 現(xiàn)。該種工藝的光敏水凝膠預(yù)先存儲(chǔ) 在成形室內(nèi)，會(huì)造成材料浪費(fèi)，以及難 以制造多種細(xì)胞的異質(zhì)結(jié)構(gòu)，且光敏 水凝膠多具有不同程度的毒性，使得 該種工藝的細(xì)胞存活率一般。代表的 研究機(jī)構(gòu)有美國(guó)加州大學(xué)圣地亞哥分 校的Chen Shaochen課題組。

4.5 聲波驅(qū)動(dòng)式細(xì)胞打印技術(shù)
聲波驅(qū)動(dòng)式細(xì)胞打印技術(shù)是利用 聲波的振動(dòng)產(chǎn)生微滴噴射的方法，其 精度最小可達(dá) 10μ m左右，但該工藝 也是微滴噴射的方法，難以噴射高 粘度的生物材料，使得打印三維生 物學(xué)結(jié)構(gòu)體的能力受到限制。代表 的研究機(jī)構(gòu)有美國(guó)Stanford大學(xué)的 Demirci教授課題組。
綜上所述，各種細(xì)胞打印方法各 有所長(zhǎng)，但對(duì)于具有三維復(fù)雜異質(zhì)生

物學(xué)結(jié)構(gòu)體來(lái)說(shuō)，微擠出式細(xì)胞三維 打印技術(shù)更為合適，其構(gòu)建多細(xì)胞三 維模型更容易，效率更高，細(xì)胞存活 率高，打印精度(百微米級(jí))也能滿(mǎn)足 一般科研使用需求。所以，目前市場(chǎng) 上主流的細(xì)胞 3D打印機(jī)多是基于該 技術(shù)實(shí)現(xiàn)，代表公司有德國(guó)Envision TEC公司、瑞士Regen Hu公司，國(guó)內(nèi) 的上普博源(北京)生物科技有限公司(SunP Biotech)、捷諾飛生物科技股 份有限公司等。

5 細(xì)胞 3D 打印的生物墨水分類(lèi)
微擠出式細(xì)胞三維打印的生物 墨水有很多種，根據(jù)其溶膠-凝膠固 化轉(zhuǎn)變?cè)�理可以分為以下幾種方式( 表 2 )。

5.1 溫敏水凝膠生物墨水
溫敏水凝膠生物墨水可以通過(guò) 環(huán)境溫度的改變實(shí)現(xiàn)其溶膠-凝膠 方式的轉(zhuǎn)變。凝膠-溶膠轉(zhuǎn)變溫度在 0 ~37°C之間且生物相容性好的水 凝膠材料均有能力作為細(xì)胞打印墨 水。最具代表性的溫敏水凝膠細(xì)胞 打印墨水為明膠。溫敏水凝膠的溶膠 到凝膠的轉(zhuǎn)變方式一般為可逆的，且 只要材料溫度達(dá)到轉(zhuǎn)變溫度即可轉(zhuǎn) 變，無(wú)需使用液體交聯(lián)劑，不受交聯(lián)劑 滲透深度影響，也不易出現(xiàn)液體交聯(lián) 劑導(dǎo)致三維打印離散層層堆積時(shí)，層 與層之間出現(xiàn)的層間剝離現(xiàn)象，易于 構(gòu)建大尺寸的三維細(xì)胞結(jié)構(gòu)體。

5.2 離子交聯(lián)式生物墨水
以海藻酸鈉為代表的水凝膠材 料，可以通過(guò)與離子溶液相接觸的方 式進(jìn)行交聯(lián)固化，實(shí)現(xiàn)溶膠-凝膠方 式的轉(zhuǎn)變。但是此種離子置換的交聯(lián) 方式反應(yīng)很快，難以利用生物墨水與 交聯(lián)劑預(yù)混合的方式打印，一般只能 利用含離子的液體進(jìn)行浸泡或噴射在 生物墨水表面進(jìn)行交聯(lián)。但細(xì)胞三維 打印機(jī)若使用液體浸泡的方式進(jìn)行 交聯(lián)，易出現(xiàn)前文提到的層間剝離現(xiàn) 象，不利于打印三維生物學(xué)結(jié)構(gòu)體。

5.3 酶促交聯(lián)式生物墨水
以纖維蛋白原為代表的水凝 膠材料，可以通過(guò)與生物酶相接觸的 方式進(jìn)行交聯(lián)，實(shí)現(xiàn)溶膠-凝膠方式 的轉(zhuǎn)變。此種酶促交聯(lián)方式一般反應(yīng) 較慢，生物酶可以混入液體制成交聯(lián) 劑，通過(guò)液體浸泡的方式進(jìn)行交聯(lián)，也 可以與水凝膠生物墨水預(yù)混合后，待 時(shí)間孵育交聯(lián)。但溶膠到凝膠轉(zhuǎn)變反 應(yīng)慢，也增加了成形難度，不易于直接 打印三維結(jié)構(gòu)體。

5.4 紫外光固化
部分合水凝膠材料經(jīng)過(guò)合成改 性，再加入光引發(fā)劑，使得水凝膠生物 墨水具有光敏特性，可以通過(guò)紫外光 進(jìn)行交聯(lián)固化(例如G e l M A 等)。光 敏水凝膠一般強(qiáng)度高，紫外光的滲透 深度比一般液體交聯(lián)劑的滲透深度更 深，但光引發(fā)劑的引入，會(huì)降低生物墨 水的生物活性。

6 細(xì)胞3D打印的未來(lái)
盡管目前細(xì)胞 3D打印已能打印 多種細(xì)胞，甚至可以構(gòu)建一些簡(jiǎn)單的 組織等，但其距離器官打印還有一段 距離，未來(lái)值得關(guān)注一下幾方面的研 究突破或趨勢(shì)變化，以促進(jìn)細(xì)胞 3D打 印技術(shù)的向前發(fā)展。

6.1 研究新型生物墨水
目前，尚不存在理想型的生物墨 水。基于天然生物材料的墨水生物相 容性好，但大多難以打印或力學(xué)性能 不好。基于人工合成高分子材料的墨 水打印性能或力學(xué)性能較好，但生物 活性一般較差，甚至有些材料沒(méi)有經(jīng) 過(guò)F D A認(rèn)證。未來(lái)，研發(fā)打印性能和 生物學(xué)性能兼優(yōu)的生物墨水將是行業(yè) 不可避免的趨勢(shì)。

6.2 產(chǎn)業(yè)化促進(jìn)整個(gè)領(lǐng)域快速向前
隨著生物 3D打印產(chǎn)業(yè)化的不斷 成熟，越來(lái)越多的廠商開(kāi)始開(kāi)發(fā)商業(yè) 化的生物 3D打印機(jī)，生物 3D打印機(jī) 的功能越來(lái)越強(qiáng)大，價(jià)格越來(lái)越低 廉。這使得新進(jìn)入這個(gè)交叉領(lǐng)域的研 究者，尤其是材料學(xué)家，生物學(xué)家，醫(yī) 生等非機(jī)械電子專(zhuān)業(yè)的研究者，可以 無(wú)需花精力在自己不擅長(zhǎng)的打印機(jī)開(kāi) 發(fā)領(lǐng)域，而專(zhuān)注于生物墨水的研發(fā)及 組織或器官的構(gòu)建研究。因此，細(xì)胞 3D打印機(jī)的產(chǎn)業(yè)化正在促進(jìn)這個(gè)領(lǐng) 域更快的發(fā)展。

6.3 提供細(xì)胞 3D 打印的專(zhuān)業(yè)化 服務(wù)將是未來(lái)的趨勢(shì)
細(xì)胞 3D打印的交叉學(xué)科特性及 技術(shù)挑戰(zhàn)，決定了其入門(mén)具有一定的門(mén)檻。因此，通過(guò)與有經(jīng)驗(yàn)的科研機(jī) 構(gòu)合作，或?qū)ふ矣薪?jīng)驗(yàn)的公司進(jìn)行技 術(shù)服務(wù)，將是此領(lǐng)域新入門(mén)者快速 獲取知識(shí)并取得科研成果的便捷途 徑。據(jù)此預(yù)測(cè)，具有高校研究背景的 細(xì)胞 3D打印的專(zhuān)業(yè)化服務(wù)公司將會(huì) 越來(lái)越多。

7 結(jié)語(yǔ)
近年，細(xì)胞 3D打印技術(shù)隨著生物 3D打印機(jī)和生物墨水的產(chǎn)業(yè)化已走 進(jìn)越來(lái)越多的實(shí)驗(yàn)室，更多的交叉領(lǐng) 域研究者一起投身到這個(gè)實(shí)現(xiàn)人類(lèi)器 官再造夢(mèng)想的領(lǐng)域。相信隨著細(xì)胞 3D 打印領(lǐng)域的不斷蓬勃發(fā)展，實(shí)現(xiàn)器官 打印的那天也不會(huì)太遙遠(yuǎn)。

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作者：趙  雨     上普博源(北京)生物科技有限公司

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