基于液滴 3D 低溫生物打印技術(shù)構(gòu)建自立式立體結(jié)構(gòu)

來源：EFL生物3D打印與生物制造

在組織工程與再生醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，液滴生物打印技術(shù)因具有高分辨率、非接觸式操作等優(yōu)勢而備受關(guān)注，但其依賴低黏度生物墨水，導(dǎo)致打印結(jié)構(gòu)缺乏自支撐性，難以構(gòu)建復(fù)雜3D立體結(jié)構(gòu)，且多材料圖案化需繁瑣的層間交聯(lián)步驟，限制了應(yīng)用場景。來自哈佛醫(yī)學(xué)院的Yu Shrike Zhang教授團(tuán)隊(duì)開發(fā)了一種液滴3D低溫生物打印技術(shù)，通過將液滴打印與低溫打印結(jié)合，利用低溫板（-5至-15℃）使低黏度生物墨水（如7.5% GelMA）在沉積后立即凍結(jié)，無需額外支撐即可形成自立式結(jié)構(gòu)，同時(shí)避免多材料混合問題。該技術(shù)成功打印出金字塔、多層網(wǎng)格及字母“H”“V”等單材料或多材料復(fù)雜結(jié)構(gòu)，并實(shí)現(xiàn)了C2C12肌成纖維細(xì)胞、NIH/3T3成纖維細(xì)胞等多種細(xì)胞的封裝，細(xì)胞存活率在培養(yǎng)2-3周后達(dá)80%-90%，還構(gòu)建了血管化乳腺癌模型驗(yàn)證多細(xì)胞共培養(yǎng)潛力。相關(guān)工作以“Droplet 3D cryobioprinting for fabrication of free﹕tanding and volumetric structures”為題發(fā)表在《Aggregate》上。

研究內(nèi)容
1. 液滴低溫生物打印機(jī)示意圖及可實(shí)現(xiàn)的結(jié)構(gòu)示例，通過自主搭建的雙微閥低溫打印系統(tǒng)，結(jié)合壓力調(diào)控（100-300 mbar）與低溫板（-5至-15℃）凍結(jié)技術(shù)，研究了低黏度生物墨水（7.5% GelMA）的3D打印能力。結(jié)果表明，系統(tǒng)可生成1-10 nL穩(wěn)定液滴，通過單/多材料噴射成功構(gòu)建金字塔、多層網(wǎng)格及字母“H”“V”等自立式結(jié)構(gòu)，驗(yàn)證了低溫凍結(jié)對維持低黏度墨水空間形態(tài)的關(guān)鍵作用，避免傳統(tǒng)液滴打印的擴(kuò)散坍塌問題。   

圖1. 液滴低溫生物打印機(jī)示意圖及可實(shí)現(xiàn)的結(jié)構(gòu)示例。   

2. 液滴尺寸與打印高寬比量化分析圖，利用光學(xué)成像系統(tǒng)（SmartDrop）和流變儀，研究了壓力、閥門開啟時(shí)間（500-700 µs）及打印頻率（0.1-20 Hz）對液滴體積和結(jié)構(gòu)高寬比的影響。結(jié)果顯示，低壓力（100 mbar）與短開啟時(shí)間（500 µs）產(chǎn)生最小液滴（0.8 nL），低溫板溫度越低（如-15℃）、頻率越低（如0.1 Hz），結(jié)構(gòu)高寬比越高（>4），且凍結(jié)后水凝膠儲(chǔ)存模量從室溫的0.01 Pa·s躍升至50 Pa·s以上，揭示了低溫通過增強(qiáng)材料彈性維持打印結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性的機(jī)制。   

圖2. 液滴低溫生物打印的打印性能。   

3. 細(xì)胞封裝存活率與形態(tài)演變圖，通過活/死染色（Calcein-AM/PI）和免疫熒光染色（F-actin/DAPI），研究了C2C12肌細(xì)胞、NIH/3T3成纖維細(xì)胞在-5℃/-10℃打印后的存活與增殖行為。結(jié)果表明，初始存活率約50%，培養(yǎng)14天后升至80%-90%，細(xì)胞呈擴(kuò)散生長并形成互連網(wǎng)絡(luò)；星形膠質(zhì)細(xì)胞在3%低濃度GelMA中鋪展面積更大（14天達(dá)初始3倍），但結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性隨濃度降低而下降，提示需平衡細(xì)胞活性與力學(xué)性能。   

圖3. 液滴低溫生物打印C2C12和NIH/3T3細(xì)胞。   

4. 不同GelMA濃度下星形膠質(zhì)細(xì)胞打印表征圖，通過對比3%與7.5% GelMA濃度，研究了水凝膠剛度對星形膠質(zhì)細(xì)胞行為的影響。結(jié)果顯示，3% GelMA組第7天存活率（80%）顯著高于7.5%組（60%），細(xì)胞覆蓋面積在14天達(dá)到7.5%組的2.3倍，但低濃度水凝膠在培養(yǎng)后期出現(xiàn)輕微結(jié)構(gòu)坍塌，表明軟基質(zhì)促進(jìn)細(xì)胞鋪展但需優(yōu)化長期穩(wěn)定性。   

圖4. 不同GelMA濃度的液滴低溫生物打印及細(xì)胞行為分析。   

5. 多材料空間異質(zhì)性結(jié)構(gòu)打印圖，利用雙微閥系統(tǒng)加載熒光染料標(biāo)記的GelMA，研究了多材料分層打印的可行性。結(jié)果表明，低溫凍結(jié)可防止不同材料混合，成功打印交替層狀網(wǎng)格結(jié)構(gòu)，界面清晰無擴(kuò)散；進(jìn)一步構(gòu)建MCF-7腫瘤細(xì)胞與HUVEC血管內(nèi)皮細(xì)胞的共培養(yǎng)模型，證明兩種細(xì)胞在21天內(nèi)保持空間分隔并正常增殖，驗(yàn)證了模擬復(fù)雜組織微環(huán)境的能力。   

圖5. 液滴低溫生物打印的多材料結(jié)構(gòu)。   

6. 血管化乳腺癌模型共培養(yǎng)表征圖，通過分層打印兩層MCF-7細(xì)胞（2.5×10⁶ cells/mL）與兩層GFP標(biāo)記HUVECs（5×10⁶ cells/mL），研究了多細(xì)胞類型的空間分布與相互作用。結(jié)果顯示，HUVECs在腫瘤細(xì)胞層上方形成血管樣結(jié)構(gòu)，培養(yǎng)21天后交界處可見內(nèi)皮細(xì)胞向腫瘤細(xì)胞方向萌芽，兩組細(xì)胞存活率分別達(dá)90%和80%，證實(shí)該技術(shù)在構(gòu)建血管化腫瘤模型中的應(yīng)用潛力。   

圖6. 液滴低溫生物打印構(gòu)建的血管化乳腺癌模型。

研究結(jié)論
本研究開發(fā)了液滴3D低溫生物打印技術(shù)，融合液滴打印與低溫凍結(jié)，解決了傳統(tǒng)液滴打印難以構(gòu)建復(fù)雜3D自立結(jié)構(gòu)的難題。系統(tǒng)可生成1-10 nL液滴，通過-5至-15℃低溫板實(shí)現(xiàn)低黏度水凝膠（如7.5% GelMA）的快速固化，成功打印單/多材料立體結(jié)構(gòu)（如金字塔、血管化腫瘤模型），結(jié)構(gòu)高寬比最高達(dá)4以上。細(xì)胞封裝實(shí)驗(yàn)表明，C2C12、NIH/3T3等細(xì)胞在打印后培養(yǎng)14天存活率達(dá)80%-90%，星形膠質(zhì)細(xì)胞在3%低濃度水凝膠中鋪展更佳。多材料打印證實(shí)該技術(shù)可精準(zhǔn)控制細(xì)胞空間分布，構(gòu)建的血管化乳腺癌模型中腫瘤細(xì)胞與內(nèi)皮細(xì)胞保持功能活性。本研究為復(fù)雜組織工程結(jié)構(gòu)和多細(xì)胞共培養(yǎng)模型的構(gòu)建提供了新方法，但其在大尺寸結(jié)構(gòu)打印和細(xì)胞長期活性調(diào)控方面仍需優(yōu)化。

文章來源：
https://doi.org/10.1002/agt2.599