3D打印仿哈弗斯骨結構——仿生細胞再生

來源：增材之光

近日，中國科學院上海硅酸鹽研究所吳成鐵研究員與常江研究員帶領的研究團隊在3D打印仿哈弗斯骨結構生物陶瓷支架用于多細胞遞送和骨組織再生方面取得新進展。該研究團隊通過模擬骨的多級結構及多細胞組成，采用光固化3D打印技術制備出仿哈弗斯骨結構生物陶瓷支架，并負載骨髓間充質干細胞和內皮細胞，促進血管化骨的修復。該研究成果近日發(fā)表在Science子刊Science Advances雜志(Sci. Adv. 2020; 6 : eaaz6725)上，并申請專利一項。論文第一作者為上海硅酸鹽所在讀博士生張猛，指導教師為吳成鐵研究員。

支架的制造是成功進行骨再生的核心，但這仍然是醫(yī)學領域中仍然很困難，盡管已經(jīng)進行了大量的研究項目，從使用納米管的變化到控制抗生素釋放、替代材料和涂層的結構。

正如作者所指出的那樣，雖然生物打印是醫(yī)學研究的一個領域，科學家已經(jīng)取得了長足的進步，但仍然有許多原因導致障礙：
•層次結構的復雜性
•機械性能要求
•骨駐留細胞的多樣性

然而，大多數(shù)再生發(fā)生在松質骨中，因此，研究人員在成功治療患者時必須關注的重點：

松質骨是由板狀或棒狀結構組成的網(wǎng)狀結構，厚度約為200毫米。據(jù)估計，80％的骨重塑過程發(fā)生在松質骨中。但是，骨骼再生不僅需要重建骨骼結構，還需要修復血管或神經(jīng)等其他組織。

仿生結構正顯示出作為“高性能骨組織工程生物材料”的巨大潛力，這使得研究團隊將重點放在使用3D打印哈弗斯生物陶瓷結構上，該結構可以以“簡單而通用的設計”模仿骨骼。

該團隊將骨的哈弗斯管、福爾克曼管及松質骨三部分結構一體化打印，通過改變哈弗斯管數(shù)量、直徑以及福爾克曼管數(shù)量實現(xiàn)了對結構的精細調控，同時也實現(xiàn)了對力學強度及孔隙率的調控，能夠滿足不同患者的個性化定制需求。該研究還模擬骨的多細胞組成，將具有成血管作用的內皮細胞負載于哈弗斯管，將具有成骨作用的骨髓間充質干細胞負載于松質骨結構，并將兩種細胞共培養(yǎng)，實現(xiàn)了多細胞的負載與運輸，顯著促進了兩種細胞的增殖以及各自成骨、成血管基因的表達。動物體內實驗表明負載兩種共培養(yǎng)細胞支架的體內成骨、成血管效果顯著優(yōu)于單培養(yǎng)細胞支架及無細胞支架，體現(xiàn)了這種多細胞遞送系統(tǒng)的血管化骨修復能力。這種基于仿哈弗斯骨結構的多細胞遞送系統(tǒng)還可以遞送多種骨組織常駐細胞，由于哈弗斯管內有血管和神經(jīng)并行穿過，該團隊還將具有神經(jīng)修復作用的雪旺細胞負載于哈弗斯管內，將骨髓間充質干細胞負載于松質骨結構，發(fā)現(xiàn)負載兩種共培養(yǎng)細胞支架的成神經(jīng)基因表達顯著優(yōu)于單培養(yǎng)細胞支架，體現(xiàn)了這種基于仿哈弗斯骨結構支架的多細胞遞送系統(tǒng)的普適性特征，可模擬體內多細胞組織工程的再生微環(huán)境。

具有皮質骨和松質骨結構的哈弗斯骨模擬生物陶瓷支架的3D打印。皮質骨結構包含哈弗斯管和福爾克曼管。（A到E）光學顯微鏡圖像顯示出不同的直徑（D）和由洋紅色箭頭（A）表示的哈弗斯管的數(shù)量（N）N = 8，D = 0.8 毫米；（B）N = 8，D = 1.2毫米；（C）N = 8，D = 1.6毫米；（D）N = 4，D = 1.6毫米; （E）N = 2，D = 1.6毫米。比例尺，1毫米。（A到E）微型計算機斷層掃描（CT）圖像顯示連接支架內部的哈弗斯管的福爾克曼管（藍色箭頭）。比例尺，1毫米。（F至J）SEM圖像顯示了支架的微觀結構。

研究人員表示：“相互連接的哈弗斯管是從松質骨結構中分離出來的，用于非接觸式細胞共培養(yǎng)。此外，將支架的外圍和底部密封起來，以便可以將支架用于固定接種的細胞。”

創(chuàng)建支架需要幾種不同的技術，包括使用靜電紡絲和雙螺桿擠出，模塊化組織工程和3D打印。該團隊在DLP 3D打印方面取得了最大的成功，設計了一系列具有哈弗斯管，福爾克曼管和松質骨的結構。

用于HBMSC-HUVEC共培養(yǎng)系統(tǒng)的仿生骨仿生生物陶瓷支架在細胞增殖和血管生成分化方面的表現(xiàn)比單培養(yǎng)更好。（A到D）接種在松質骨結構上的HBMSC的CLSM圖像（A）和接種在哈弗斯管上的HUVEC直徑不同，（B）D = 1.6毫米，（C）D = 1.2毫米，（D）D = 0.8毫米。比例尺，100微米。（E到H）SEM圖像，（E）接種在松質骨結構上的HBMSC和HUVEC接種在哈弗斯管上，直徑分別為（F）1.6毫米，（G）1.2毫米和（H）0.8毫米。（I和J）培養(yǎng)1、3、7、14天后，接種在具有不同（I）直徑和（J）哈弗斯支架上的HBMSC，HUVEC和共培養(yǎng)的HBMSC-HUVEC的增殖活性。n = 6個重復。（K和L）HBMSC，HUVEC，Co-HBMSC（HBMSC-HUVEC共培養(yǎng)中的HBMSC）和Co-HUVEC（HBMSC-HUVEC共培養(yǎng)中的HUVEC）的成骨（K）和血管生成（L）基因表達，持續(xù)3天。n = 3個重復。* P <0.05，** P <0.01，*** P <0.001，$ P <0.05，$$ P <0.01。

基于哈弗斯的模仿生物陶瓷支架的rBMSC-rSC共培養(yǎng)系統(tǒng)在細胞增殖和神經(jīng)原性分化方面比單培養(yǎng)表現(xiàn)更好。（A到D）（A）rBMSC單培養(yǎng)組和rBMSC-rSC共培養(yǎng)組中rBMSC的CLSM圖像，其中rBMSC與rSC的比率為（B）3：7，（C）5：5和（D） 7：3負載在支架的松質骨上。比例尺，50微米。（E到H）（E）rSC單培養(yǎng)組和rBMSC-rSC共培養(yǎng)組中rSC的CLSM圖像，其中rBMSC與rSC的比率為（F）3：7，（G）5：5和（H） 7：3負載在哈弗斯管支架上。

“在這里，我們進一步建立了基于哈弗斯仿骨支架的rBMSC-rSC共培養(yǎng)系統(tǒng)，其中在松質骨結構中生長的rBMSC和在哈弗斯管中生長的rSC。我們的結果表明，與rSC單培養(yǎng)相比，rBMSC-rSC共培養(yǎng)系統(tǒng)表現(xiàn)出更好的增殖和NGF，BDNF，TrkA和S100的更高表達。發(fā)現(xiàn)骨髓間充質干細胞可以促進SC增殖，傳統(tǒng)上被用于促進感覺系統(tǒng)的恢復。”研究團隊表示。

考慮到哈弗斯仿骨支架的臨床應用，仍有一些問題需要研究。首先，在共培養(yǎng)系統(tǒng)中應進一步考慮更多的骨駐留細胞，例如成骨細胞，破骨細胞和巨噬細胞。多細胞協(xié)同作用的機制尚不完全清楚。需要進一步的研究來確定共培養(yǎng)細胞對基于哈弗斯仿骨支架的共培養(yǎng)系統(tǒng)中新骨骼，血管和神經(jīng)形成的個體影響。