清華《AFM》：3D打印載細胞的高保真微凝膠雙相生物墨水,！

來源：材料科學與工程

生物打印因其能夠精確地將細胞和材料(即生物墨水)沉積到3D復雜結(jié)構(gòu)中而引起人們的極大興趣,，在工程體外生命系統(tǒng)中的應(yīng)用可用于疾病建模和組織再生,。到目前為止，已經(jīng)開發(fā)了各種生物打印技術(shù),，例如噴墨生物打印和基于數(shù)字光處理(DLP)的生物打印,。其中，最常見的方式是擠壓生物打印,，其中生物墨水需要擠壓然后快速穩(wěn)定,。3D擠壓生物打印的一個主要挑戰(zhàn)是生物墨水的數(shù)量有限，這些墨水滿足了具有必要流變特性的適印性和具有所需微環(huán)境的功能的相反要求,。

來自清華大學的學者通過開發(fā)一種通用策略來解決這一限制,，該策略用于配制基于細胞的微凝膠(MB)生物墨水,。MB生物油墨包括兩個組分，即緊密堆積狀態(tài)的微凝膠為擠壓生物印刷提供優(yōu)異的流變性能,，以及形成第二聚合物網(wǎng)絡(luò)以將微凝膠整合在一起的水凝膠前體,，從而提供印刷后結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性。這一策略可以將一系列水凝膠打印成形狀保真度高的復雜結(jié)構(gòu),。MB生物油墨具有極好的機械可調(diào)性而不會影響印刷性能,，并且具有超強的彈性和卓越的循環(huán)壓縮和拉伸耐久性。此外,，MB生物墨水的微凝膠和水凝膠前體可以包裹不同類型的細胞,，共同創(chuàng)造一個微尺度的異質(zhì)細胞微環(huán)境。利用MB生物墨水對肝細胞和內(nèi)皮細胞進行空間構(gòu)圖,，成功地誘導了細胞的重組和血管化,，從而增強了肝功能。本文提出的MB生物墨水擴展了現(xiàn)有生物墨水的調(diào)色板,，并為組織工程和軟機器人等生物醫(yī)學應(yīng)用打開了無數(shù)機會,。相關(guān)文章以“3D Printing of Cell-Laden Microgel-Based Biphasic Bioink with Heterogeneous Microenvironment for Biomedical Applications”標題發(fā)表在Advanced Functional Materials。

論文鏈接：https://doi.org/10.1002/adfm.202109810

圖1,。負載細胞的MB生物墨水的制造和3D打印,。a)水凝膠生物墨水和MB生物墨水示意圖。b)使用MB生物墨水的3D打印網(wǎng)狀結(jié)構(gòu),。c)MB生物墨水,，以微凝膠(5.0wt%GelMA，紅色熒光標記)為離散相,，第二聚合物網(wǎng)絡(luò)(5.0wt%GelMA,，綠色熒光標記)為連續(xù)相。d)逐步說明MB生物墨水的制造過程,。鈣調(diào)素-AM/PI染色顯示C2C12S微凝膠活性高,。

圖2.MB生物墨水的流變特性和組成的多樣性。a)純水凝膠生物墨水和MB生物墨水的示意圖,。b)純水凝膠,、MB墨水和JM墨水(均含有5.0wt%GelMA)的流變特性均隨剪切速率的增加而降低(0-50 s−1)。c)流變特性表明MB墨水和JM墨水的剪切模量與溫度無關(guān),，而GelMA水凝膠有臨界的凝膠-溶膠相變點,。微凝膠含量分別為80%、85%和95%的MB生物油墨的流變特性顯示：d)剪切變稀特性,，e)應(yīng)變屈服隨應(yīng)變增加(0-300%,，1Hz)，以及f)通過低(無陰影,，1%應(yīng)變,，1 Hz)和高(陰影,，300%應(yīng)變，1 Hz)應(yīng)變循環(huán)進行自愈,。

圖3.使用MB生物墨水的3D打印能力和保真度,。a-i)MB生物墨水的細絲擠出和ii)共聚焦顯微鏡下的放大觀察，微凝膠(5.0wt%GelMA)標記為紅色熒光,，第二水凝膠(5.0wt%GelMA)標記為綠色熒光,。b)3D打印網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)i)使用MB生物墨水，具有放大視圖ii)在交叉口,。c)3D打印雙環(huán)i)在可見光(405Nm)曝光時交聯(lián),，與GelMA微凝膠ii)在共聚焦顯微鏡下的圖像。d)3D打印管狀結(jié)構(gòu)(左視圖,、俯視圖,；右視圖、側(cè)視圖),。

圖4.MB生物墨水印刷構(gòu)件的機械特性,。a)典型的應(yīng)力-應(yīng)變曲線和b)分別使用5wt%GelMA水凝膠、MB墨水和JM墨水的印刷圓柱體的壓縮彈性模量,。c)使用JM油墨在60%應(yīng)變下進行20次壓縮循環(huán)的印刷圓柱體的循環(huán)耐久性試驗,。d)使用60%應(yīng)變的MB墨水在1000次壓縮循環(huán)中對印刷圓筒進行循環(huán)耐久試驗。

圖5.3D打印可調(diào)節(jié)異質(zhì)微環(huán)境的血管化肝組織結(jié)構(gòu),。a)每種類型細胞的示意圖,，即HepG2(紅色)和HUVECs(綠色)，水凝膠生物墨水和含7.5wt%GelMA的MB生物墨水的細胞空間排列,。b)在i)第1天和ii)第3天使用水凝膠生物墨水在印刷纖維內(nèi)的HepG2(紅色)和HUVECs(綠色)細胞,，用白色虛線表示印刷纖維的邊界。c)第一天和第三天使用MB生物墨水的印刷纖維內(nèi)的HepG2(紅色)和HUVECs(綠色)細胞,。

圖6.肝功能和肝臟特異性基因和蛋白表達水平的評估,。a)CCK-8比色法測定細胞增殖。b)酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)分析白蛋白分泌,。c)用酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)分析尿素產(chǎn)量,。d)CYP3A4和CYP1A1酶活性分析。e)在第10天比較純GelMA水凝膠和MB生物墨水印制的肝構(gòu)建物的ALB,、TTR和AFP表達水平,。

總之，本文引入了細胞負載微凝膠雙雙相(MB)生物墨水的概念,，作為3D擠壓生物打印的通用策略。MB生物墨水由細胞包裹的微凝膠組成,，這些微凝膠被堵塞并通過第二個交聯(lián)聚合物網(wǎng)絡(luò)連接,。這種方法利用MB生物墨水的流變特性(即剪切變稀,、屈服應(yīng)力和自恢復)提供了延長的生物制造窗口，從而具有優(yōu)異的生物印刷能力,。本文打印了包括鼻子,、耳朵、支氣管和腦模型在內(nèi)的3D復雜結(jié)構(gòu),，形狀逼真,。此外，MB生物油墨在機械性能上具有很好的可調(diào)性,，并且不犧牲其印刷性能,，而且表現(xiàn)出超彈性行為、卓越的循環(huán)壓縮和拉伸耐久性,�,？傮w而言，MB生物墨水具有機械可調(diào)諧,、超彈性和異質(zhì)微環(huán)境的設(shè)計靈活性,，為組織工程和軟機器人等生物醫(yī)學應(yīng)用中的3D生物打印打開了新的可能性。