美國(guó)賓夕法尼亞大學(xué)：調(diào)整灰白質(zhì)比即可輕松模仿脊髓機(jī)械異質(zhì)性

來(lái)源：EngineeringForLife

生物工程支架具有模擬組織機(jī)械性能的特質(zhì),，但天然組織的機(jī)械性能通常是不均勻的且難以表征,，特別是脊髓的神經(jīng)特性,。遞送到受傷脊髓以刺激軸突連接的支架通常使用沿著頭-尾軸的引導(dǎo)線索匹配天然組織的各向異性,，但是當(dāng)前的方法沒(méi)有模擬宿主組織力學(xué)的異質(zhì)性,。基于此,，來(lái)自美國(guó)賓夕法尼亞大學(xué)的Paul A. Janmey團(tuán)隊(duì)描述了一種修改DLP打印支架的方法,，該支架模擬由白質(zhì)和灰質(zhì)比例變化引起的脊髓機(jī)械異質(zhì)性，與表現(xiàn)出均勻機(jī)械特性的對(duì)照組相比,，這種方法能夠有效改善軸突浸潤(rùn),。

相關(guān)研究成果以“Matching mechanical heterogeneity of the native spinal cord augments axon infiltration in 3D-printed scaffolds”為題于2023年2月16日發(fā)表在《Biomaterials》上。

1. 脊髓力學(xué)性能的微結(jié)構(gòu)表征
為了檢查脊髓組織的異質(zhì)性,，作者首先進(jìn)行了使用AFM和張力計(jì)的初步實(shí)驗(yàn),，以詢(xún)問(wèn)沿著橫向解剖平面的灰質(zhì)和白質(zhì)的差異。為了澄清這些研究之間的差異,，對(duì)脊髓進(jìn)行了AFM和張力測(cè)量實(shí)驗(yàn)(圖1A-B),。將組織分為三個(gè)區(qū)域：骶骨,、胸/腰椎和頸椎，以評(píng)估解剖水平是否影響脊髓的機(jī)械性能,。AFM以前已經(jīng)被用來(lái)表征脊髓力學(xué),，顯示灰質(zhì)比白質(zhì)表現(xiàn)出顯著更高的彈性模數(shù)，盡管在三個(gè)水平之間沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(圖1C),。圖1D顯示了所有三個(gè)區(qū)域的灰質(zhì)和白質(zhì)的松弛因子,，雙因素方差分析顯示灰質(zhì)和白質(zhì)之間存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，盡管水平之間沒(méi)有差異,。這些結(jié)果表明,，與白質(zhì)相比，灰質(zhì)表現(xiàn)出更堅(jiān)硬和更多的粘彈性力學(xué),，并且灰質(zhì)和白質(zhì)沿脊髓長(zhǎng)度的微觀結(jié)構(gòu)力學(xué)性質(zhì)沒(méi)有差異,。為了驗(yàn)證這種力學(xué)異質(zhì)性也存在于大鼠脊髓內(nèi)，對(duì)大鼠脊髓頸部水平的切片進(jìn)行了原子力顯微鏡檢查,，發(fā)現(xiàn)灰質(zhì)區(qū)域的彈性模數(shù)明顯高于周?chē)�白質(zhì)區(qū)域。

圖1 牛脊髓組織的微結(jié)構(gòu)力學(xué)特性

之后流變學(xué)被用來(lái)描述頸椎,、腰椎和骶骨水平的脊髓的體積力學(xué)特征,。對(duì)來(lái)自三個(gè)獨(dú)立牛脊髓的每個(gè)水平(頸椎、腰椎和骶椎)的三個(gè)不同切片進(jìn)行了流變學(xué)檢測(cè),。給定AFM測(cè)試的結(jié)果,，這些實(shí)驗(yàn)測(cè)試了這樣的假設(shè)，即解剖層面的整體力學(xué)性質(zhì)的差異是由于灰質(zhì)與白質(zhì)的比例不同,。因此,，在取自不同水平的5-6 mm厚的脊髓橫切面上測(cè)量了剪切儲(chǔ)能和損耗模量以及灰質(zhì)和白質(zhì)的橫截面積。圖2A-C顯示了在三種不同的牛脊髓上進(jìn)行的流變學(xué)實(shí)驗(yàn),。其中兩只動(dòng)物的頸部和第三只動(dòng)物的骶部測(cè)得了最高的存儲(chǔ)和損失模數(shù),。為了使整體測(cè)試與AFM測(cè)量結(jié)果一致，即在脊髓的灰質(zhì)或白質(zhì)中沒(méi)有發(fā)現(xiàn)差異,，脊髓橫切面(圖2D-F),，橫切面中灰質(zhì)的百分比表示為總面積的百分比(圖2G-I)。這些結(jié)果表明,，沿臍帶的整體流變特性是由臍帶橫截面中灰質(zhì)與白質(zhì)的比率的差異決定的,。

圖2 脊髓組織宏觀結(jié)構(gòu)力學(xué)特性的表征

2. 灰質(zhì)和白質(zhì)的顯微結(jié)構(gòu)分析
為了深入了解導(dǎo)致機(jī)械異質(zhì)性的灰質(zhì)和白質(zhì)之間的結(jié)構(gòu)差異，采用免疫組織化學(xué)方法檢測(cè)了沿脊髓不同水平的兩個(gè)區(qū)域的細(xì)胞核,、髓鞘和層粘連蛋白表達(dá)的差異,。圖3顯示了頸椎、腰椎和腰椎在開(kāi)始處固定的切片(圖3A,、C,、E),，并在6小時(shí)后結(jié)束(圖3B、D,、F)的力學(xué)表征實(shí)驗(yàn),。DAPI、髓磷脂和層粘連蛋白的定量分析表明在所有水平的白質(zhì)和灰質(zhì)區(qū)域之間存在顯著差異,。

圖3 灰質(zhì)和白質(zhì)的免疫組織化學(xué)分析

3. 具有不同機(jī)械性能的3D打印支架
基于以上結(jié)果,，作者開(kāi)發(fā)了一種新的DLP方法來(lái)制造支架，該支架模擬了通過(guò)牛脊髓微結(jié)構(gòu)力學(xué)測(cè)試觀察到的灰色和白色區(qū)域之間的硬度差異（圖4A）,。作者創(chuàng)建了灰度圖案以在0-100%之間改變光強(qiáng)值,，代表黑色到白色，以調(diào)節(jié)GelMA水凝膠的聚合程度,。為了驗(yàn)證這種方法,，交替強(qiáng)度的測(cè)試圖案被打印在正方形塊中。圖4B顯示了用于這些初步打印的灰度掩模,，在10x10x3 mm的塊中具有1 mm厚的條紋,，用張力計(jì)量法驗(yàn)證力學(xué)性能的差異。對(duì)這些數(shù)據(jù)的量化和隨后的統(tǒng)計(jì)分析表明,，每條條紋之間存在顯著差異,，表明暴露在高光強(qiáng)下的區(qū)域表現(xiàn)出比低光強(qiáng)區(qū)域更堅(jiān)硬的力學(xué)性能(圖4C)。這些結(jié)果驗(yàn)證了3D打印支架可以實(shí)現(xiàn)異質(zhì)性,，以模擬灰質(zhì)和白質(zhì)區(qū)域之間的硬度差異,。

圖4 3D打印支架的特點(diǎn)

4. 脊髓損傷三維打印支架的力學(xué)特性研究
在驗(yàn)證了具有異質(zhì)機(jī)械性能的3D打印支架的方法后，水凝膠被打印出來(lái)以模仿大鼠T10幾何形狀,。圖5A顯示了同質(zhì)支架（以用于異質(zhì)支架白質(zhì)的相同光強(qiáng)度打�,。┖鸵粋�(gè)異質(zhì)支架中灰質(zhì)和白質(zhì)區(qū)域內(nèi)支架的SEM圖像。量化表明,，在異質(zhì)支架的模擬灰質(zhì)中孔徑減�,。▓D5B），為了進(jìn)一步驗(yàn)證模擬的白質(zhì)和灰質(zhì)之間的差異,，對(duì)暴露于不同光強(qiáng)度的散裝水凝膠進(jìn)行了壓縮測(cè)試,。壓縮測(cè)試表明，與代表白質(zhì)的水凝膠相比,，暴露于用于創(chuàng)建灰質(zhì)區(qū)域的光強(qiáng)度的水凝膠表現(xiàn)出明顯更高的彈性模量（圖5C）,。在驗(yàn)證了暴露于不同像素強(qiáng)度的支架的機(jī)械性能之間存在差異后，獲得了同質(zhì)和異質(zhì)支架的圖像,，以證明不同的剛度不會(huì)影響支架的幾何形狀（圖5E）,。圖 5F-H 顯示了均質(zhì)和異質(zhì)支架中彈性模量的熱圖，異質(zhì)支架內(nèi)的灰質(zhì)表現(xiàn)出明顯高于周?chē)�白質(zhì)和以75%強(qiáng)度打印的均質(zhì)水凝膠的彈性模量,。此外,，異質(zhì)支架中的灰質(zhì)硬度與以100%強(qiáng)度打印的同質(zhì)支架之間沒(méi)有顯著差異（圖5I）,。總之,，上述結(jié)果表明機(jī)械異質(zhì)性可以在脊髓支架中實(shí)現(xiàn),。

圖5 3D打印異質(zhì)支架的特點(diǎn)

5. 評(píng)估軸突滲透到具有異質(zhì)機(jī)械性能的支架中
最后，作者進(jìn)行移植研究以確定異質(zhì)支架與同質(zhì)對(duì)照相比是否會(huì)引起增加的軸突浸潤(rùn),。異質(zhì)支架和剛度與異質(zhì)支架匹配的同質(zhì)支架都被移植到急性脊髓損傷模型中,。圖6A顯示了T10支架的水凝膠制造、損傷模型和移植示意圖,。異質(zhì)支架顯著增強(qiáng)了感覺(jué)軸突的浸潤(rùn)（圖6C）,。為了進(jìn)一步評(píng)估軸突浸潤(rùn)到支架中，檢查了移植支架的延髓和尾部區(qū)域是否存在Tuj纖維,。圖6D顯示Tuj+軸突的存在僅位于支架的延髓區(qū)域,，具有與異質(zhì)支架的“白質(zhì)”相匹配的均質(zhì)力學(xué)。圖6E表明與灰質(zhì)匹配的均質(zhì)支架中的類(lèi)似響應(yīng),。然而,，在異質(zhì)支架的頭側(cè)和尾側(cè)部分均觀察到Tuj+纖維的浸潤(rùn)和生長(zhǎng)（圖6F），表明機(jī)械異質(zhì)性刺激了神經(jīng)元再生,。

為了確定異質(zhì)支架是否刺激軸突生長(zhǎng)增加,，在兩種支架類(lèi)型的白質(zhì)區(qū)域評(píng)估了Tuj纖維的量化，表明異質(zhì)支架顯著促進(jìn)了Tuj+纖維的生長(zhǎng)（圖6G）并刺激了浸潤(rùn)與均質(zhì)水凝膠相比的距離（圖6H）,�,？傮w而言,，這些結(jié)果表明,，具有與宿主組織各向異性相匹配的異質(zhì)機(jī)械性能的 3D 打印支架對(duì)軸突的浸潤(rùn)和再生具有有益影響。

圖6 移植后軸突浸潤(rùn)的檢查

綜上,，橫向脊髓部分的大量流變學(xué)測(cè)試表明,，脊髓的粘彈性特性沿其長(zhǎng)度發(fā)生變化。但不是由于微觀結(jié)構(gòu)特性的差異,，AFM和張力測(cè)量表明灰質(zhì)和白質(zhì)的剛度不會(huì)根據(jù)水平而變化,。因此，沿線的整體機(jī)械性能差異是由灰質(zhì)和白質(zhì)相對(duì)量的差異引起的,。對(duì)現(xiàn)有數(shù)字光處理技術(shù)的修改有助于打印具有異質(zhì)機(jī)械性能的支架,，提供了一種模擬灰質(zhì)和白質(zhì)之間剛度差異的方法。急性橫斷大鼠模型的移植實(shí)驗(yàn)表明,，與均質(zhì)機(jī)械特性相比,，具有這種異質(zhì)機(jī)械特性的支架會(huì)導(dǎo)致更大的軸突浸潤(rùn)。盡管這種差異背后的機(jī)制尚不清楚,，但這些結(jié)果強(qiáng)調(diào)了開(kāi)發(fā)模擬脊髓組織空間異質(zhì)性的生物材料的重要性,。

原文鏈接：
https://doi.org/10.1016/j.biomaterials.2023.122061