來源: EngineeringForLife
三維(3D)打印技術(shù)正在推動包括組織工程在內(nèi)的各個工程領(lǐng)域的進步,。然而,,原始的3D打印支架通常缺乏強大的功能來刺激各種再生應(yīng)用所需的活動。近日,,來自美國羅切斯特大學(xué)的Lichun Lu團隊將二維(2D)異質(zhì)納米結(jié)構(gòu)和免疫調(diào)節(jié)白細胞介素4(IL-4)細胞因子相結(jié)合,,用于3D打印支架的功能化,以實現(xiàn)促進愈合的免疫微環(huán)境,,以優(yōu)化骨損傷維修(圖1),。在大鼠體內(nèi)植入后,,具有免疫功能的 3D 支架通過構(gòu)建促愈合免疫微環(huán)境實現(xiàn)體內(nèi)骨免疫調(diào)節(jié),從而促進缺損區(qū)域的血管生成和成骨,,從而促進骨再生,。這些結(jié)果表明,具有二次加載免疫調(diào)節(jié)細胞因子的2D異質(zhì)納米結(jié)構(gòu)的3D支架的免疫功能化是改善骨再生的令人鼓舞的策略,。相關(guān)論文“3D-printed scaffolds with 2D hetero-nanostructures and immunomodulatory cytokines provide pro-healing microenvironment for enhanced bone regeneration”于2023年4月13日在線發(fā)表于雜志《Bioactive Materials》上,。
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圖1 具有2D異質(zhì)納米結(jié)構(gòu)和免疫調(diào)節(jié)細胞因子的3D打印支架的制備及使用示意圖
1. 異質(zhì)納米結(jié)構(gòu)的表征
首先,研究者合成了由氧化石墨烯(GO)層和黑磷(BP)納米片組成的2D異質(zhì)納米結(jié)構(gòu),。TEM和SEM證實了超聲處理后尺寸范圍為納米級的小BP納米片的產(chǎn)生(圖2a),,AFM表明剝落的BP納米片具有多層結(jié)構(gòu)(圖2b)。TEM圖像證實了氧化和剝落后GO納米片的產(chǎn)生(圖2c),,AFM測試檢測到高度約為1-2 nm(圖2d),。將GO納米片和BP納米片混合后,得到含有兩層二維材料的異質(zhì)納米結(jié)構(gòu),。TEM圖像表明BP納米片與GO納米片均勻分布(圖2e),,GOBP異質(zhì)納米結(jié)構(gòu)的詳細可視化表明,BP納米片被大面積GO層完全包裹,。這些表征表明,,BP納米片和GO納米片這兩種類型的二維材料并不相互排斥,因此可以成功地應(yīng)用于形成異質(zhì)納米結(jié)構(gòu)(圖2f),。
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圖2 異質(zhì)納米結(jié)構(gòu)的結(jié)構(gòu)及3D支架的表征
2. 3D聚合物支架的印刷與功能化
然后,,作者在Bio-X打印機上打印了聚合物1D支架(圖2g),將得到的3D支架浸入具有各種2D材料的溶液中,,即GO納米片,,BP納米片和GOBP異質(zhì)納米結(jié)構(gòu)進行表面功能化(圖2h),。具有3D GOBP異質(zhì)納米結(jié)構(gòu)的2D支架在深色的表面上顯示出基本的2D材料(圖2i),。3D支架的SEM顯微鏡在納米尺度上顯示了聚合物支架表面2D材料的相應(yīng)特征(圖2k-l)。在涂覆一層2D BP納米片后,,得到的3D-Scaf-BP支架具有隨機分散在表面上的BP納米片涂層,,如圖2l中的綠色所示。此外,,BP納米片可以通過與氧氣和水反應(yīng)緩慢氧化,,以連續(xù)釋放磷酸根離子(圖2m)。
3. 干細胞增殖和成骨
2D材料功能化3D支架的生物相容性對于體內(nèi)植入至關(guān)重要,�,;�/死染色和浸出培養(yǎng)基對共培養(yǎng)干細胞的活力實驗表明,功能化的3D支架對干細胞沒有細胞毒性,,也不會向培養(yǎng)基釋放有毒物質(zhì),,因此具有生物相容性,,適用于體外細胞研究和體內(nèi)植入。增殖實驗表明,,干細胞在所有4種類型的3D支架上都顯示出生長趨勢,,類似于TCPS對照(圖3c),重建的3D掃描共聚焦圖像顯示大量干細胞粘附在3D支架的頂部和內(nèi)部脊上(圖3d),,干細胞的SEM圖像與未功能化的純2D支架相比,,3D納米片上的豐度細胞和異質(zhì)納米結(jié)構(gòu)功能化的3D支架顯示出一致的趨勢(圖3e)。與干細胞共培養(yǎng)14天后,,通過免疫熒光染色可視化成骨制造蛋白OPN的表達,。結(jié)果表明,2D GO納米片和功能化支架釋放的磷酸根離子可以促進細胞成骨(圖3f-h),。
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圖3 干細胞在支架上的行為
4. 3D 支架的免疫功能和巨噬細胞反應(yīng)
將未功能化的純3D支架和2D材料功能化的3D支架全部浸入大鼠IL-4溶液中以吸收IL-4細胞因子(圖4a),。結(jié)果表明,用GO或GOBP異質(zhì)結(jié)結(jié)構(gòu)的3D支架上的IL-3負載量含量更高(圖4b-c),。在接種3,、12和24小時后測試骨髓來源巨噬細胞(rBMDM)對滅菌的免疫功能72D支架的粘附,結(jié)果表明:3D-Scaf-GOBP-免疫支架具有最多的巨噬細胞數(shù)量,,顯示出巨噬細胞吸引和增殖的最佳特性(圖4d),,免疫熒光圖像顯示出一致的結(jié)果(圖4e)。巨噬細胞表型變化結(jié)果顯示,,通過異質(zhì)納米層改進的IL-3細胞因子負載和釋放可以在粘附在3D支架上實現(xiàn)巨噬細胞的有效表型極化(圖4f-j),。
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圖4 免疫功能化和巨噬細胞表型轉(zhuǎn)變
5. 巨噬細胞對血管形成和成骨的影響
為了探索巨噬細胞響應(yīng)免疫功能3D支架是否會影響鄰近細胞的血管形成和成骨,將巨噬細胞的釋放培養(yǎng)基與HUVEC和rBMSC共培養(yǎng)(圖5a),。如圖5b-f所示,,不同基因的相對mRNA表達量不同。在與免疫功能化3D支架的IL-3細胞因子誘導(dǎo)的巨噬細胞上層共培養(yǎng)的HUVECs中檢測到血管基因表達較高的總體趨勢,。對于成骨分析,,顯示與血管標(biāo)志物相似的趨勢,其中檢測到由3D-Scaf-GOBP-免疫支架浸出培養(yǎng)基誘導(dǎo)的巨噬細胞上消化母共培養(yǎng)的rBMSC的最高值(圖5i-m),。
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圖5 體外血管形成和成骨
6. 3D免疫支架的體內(nèi)骨再生
在骨缺損部位,,損傷微環(huán)境生態(tài)位涉及各種細胞和因素(圖6a)。創(chuàng)建直徑為5 mm的全層骨缺損,,并將3D支架植入缺損中(圖6b),。4周后,收獲顱骨碎片以分析骨形成(圖6c-d),。如圖6e所示,,顯微CT圖像表明,植入3D支架的缺損部位內(nèi)的新骨形成更顯著,空對照的新骨形成最少,。對于用3D材料功能化的三種類型的2D支架,,沿著缺陷邊緣形成了小規(guī)模的完整骨塊(圖6e)。此外,,免疫調(diào)節(jié)細胞因子負荷可進一步加速骨形成(圖6f-h),。主要器官的HE染色表明,本研究中使用的3D支架在體內(nèi)條件下具有生物相容性,,與體外細胞評估一致(圖6i),。
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圖6 免疫功能支架的體內(nèi)骨形成
7. 體內(nèi)新生血管形成和成骨
為了評估在顱骨缺損部位植入的3D支架的骨修復(fù),收獲的骨組織在嵌入石蠟后進行脫鈣和切片,。圖7a-c顯示,,3D支架可以橋接骨缺損,并為細胞在骨缺損區(qū)域進行和分配提供優(yōu)異的組織導(dǎo)電性,。CD31和ALP表明支架植入促進了細胞募集和組織形成(圖7d),,熒光強度的定量結(jié)果也與之相符(圖7e-f)。
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圖7 大鼠顱骨缺損模型中的免疫組織學(xué)分析和體內(nèi)新生血管和成骨
8. 體內(nèi)M2巨噬細胞表型調(diào)節(jié)
為測定骨缺損體內(nèi)巨噬細胞募集和M2表型極化,,對顱骨進行CD68和CD206免疫熒光雙染色,。對于3D-Scaf-GOBP,在組織內(nèi)觀察到CD68和CD206熒光的廣泛分布,,表明異質(zhì)納米結(jié)構(gòu)的功能可以增強巨噬細胞對3D支架的募集(圖8a),,定量計算與熒光圖像一致(圖8b-c)。CD206熒光的體內(nèi)分布表明了偏振M2巨噬細胞的位置,,對于這些3D支架來說是獨一無二的(圖8a),。觀察到有效的CD206熒光包圍植入的3D支架脊,表征了CD206熒光強度與到支架脊表面的距離的關(guān)系(圖8d),。
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圖8 體內(nèi)巨噬細胞表型表征
綜上,,本文通過結(jié)合3D異質(zhì)納米結(jié)構(gòu)和免疫調(diào)節(jié)IL-2細胞因子,成功構(gòu)建了免疫功能化的3D支架,,并通過創(chuàng)建促愈合的免疫微環(huán)境優(yōu)化了體內(nèi)骨損傷修復(fù),。體外測試表明,由GO和BP納米片組成的二維異質(zhì)納米結(jié)構(gòu)可以提高細胞粘附,,磷酸根離子的持續(xù)釋放刺激細胞增殖和成骨,。二維異質(zhì)納米層還增加了免疫調(diào)節(jié)IL-2細胞因子的負載量,,并調(diào)節(jié)巨噬細胞極化為M2表型,,以構(gòu)建有利于愈合的免疫微環(huán)境,以改善血管生成和成骨,。體內(nèi)植入結(jié)果表明,,免疫功能化的3D支架橋接損傷缺陷,增強細胞募集,并通過磷酸鹽的持續(xù)釋放刺激體內(nèi)新生血管和成骨作用,。負載的IL-2細胞因子進一步促進了巨噬細胞極化為M3表型,,這可能有助于建立促進愈合的微環(huán)境以加速骨損傷恢復(fù)。因此,,具有免疫調(diào)節(jié)細胞因子二次加載的2D GOBP異質(zhì)納米結(jié)構(gòu)的3D支架的免疫功能化可以為3D打印的支架提供支持快速骨損傷恢復(fù)的有希望的策略,。
文章來源:https://doi.org/10.1016/j.bioactmat.2023.03.021
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