哈佛大學| 明膠纖維引導3D打印心室中的心肌細胞排列

來源： GK綠鑰生物科技

美國哈佛大學Kevin Kit Parker教授團隊在《Nature Materials》期刊發(fā)表論文“Fibre-infused gel scaffolds guide cardiomyocyte alignment in 3D-printed ventricles”,，開發(fā)了一種含有預(yù)制明膠纖維的水凝膠墨水，用于打印3D器官級支架,，再現(xiàn)心臟的細胞內(nèi)和細胞間組織,。作者通過將預(yù)制明膠纖維添加到水凝膠中可以控制墨水流變性,，實現(xiàn)受控的溶膠-凝膠轉(zhuǎn)變,，以實現(xiàn)獨立3D結(jié)構(gòu)的精確打印,，而無需額外的支撐材料。在墨水擠壓過程中,，剪切誘導的纖維排列提供了微尺度的幾何線索,，促進了體外培養(yǎng)的人類心肌細胞向各向異性肌肉組織的自組織，3D打印心室體外模型具有仿生各向異性電生理和收縮特性,。

WHAT——什么是明膠纖維？

明膠纖維是一種合成纖維,，通常由明膠為原料制成,，可以與天然的膠原纖維相媲美,，其尺寸通常在1.3 μm到8.7 μm之間，這種纖維具有較好的力學性能,，并且與某些細胞具有良好的相容性,。明膠纖維與纖維表面的相互作用原理包括物理和化學相互作用，能增加纖維之間的接觸面積,，提高結(jié)合的強度,。
WHY——為什么要用生物3D打印的方法來制造心臟組織？

目前研究人員更多是通過微接觸印刷,、光刻,、定向冷凍干燥、纖維紡絲和微生理芯片制造來設(shè)計心臟組織,，但這些方法在制造完全復(fù)制心臟功能的復(fù)雜幾何組織的能力方面受到限制,。而生物3D打印的優(yōu)勢就在于能夠制造復(fù)雜、生物相容性更強的結(jié)構(gòu),，可以精確地復(fù)制細胞和組織的原始結(jié)構(gòu),。
HOW——作者通過將明膠纖維注入明膠和海藻酸鹽(Gel-Alg)水凝膠基質(zhì)來設(shè)計墨水。

圖1 開發(fā)打印具有細胞對齊線索的獨立式3D打印組織支架的明膠墨水

將纖維融入水凝膠中可以改變墨水的流變性,，從而無需任何支撐結(jié)構(gòu)或材料即可創(chuàng)建精確且復(fù)雜的3D支架,。通過排列明膠微纖維的形式，結(jié)合拓撲和化學線索來打印的3D心室支架能促進心肌細胞自組織成各向異性肌肉組織,。在制造纖維注入凝膠(FIG)墨水后,，作者打印了由明膠纖維和Gel-Alg水凝膠組成的3D支架。在打印過程中,，噴嘴內(nèi)的剪切應(yīng)力足以使具有彈性的FIG墨水變成液體,，擠壓后恢復(fù)其彈性穩(wěn)定性。這些非線性流變特性允許FIG墨水連續(xù)擠壓,，還能夠打印復(fù)雜的幾何形狀的分層結(jié)構(gòu),，且無需犧牲層或犧牲浴作為支撐結(jié)構(gòu)，實現(xiàn)自我支撐的空心3D結(jié)構(gòu),�,？傊�，凝膠狀FIG墨水的高彈性模量提供了足夠的凝膠穩(wěn)定性,，可以打印厚度在200 μm到350 μm之間的自支撐壁,，而不需要支架或犧牲浴。

圖2 在明膠纖維灌注凝膠的打印支架上,，培養(yǎng)心臟組織的各向異性細胞內(nèi)和細胞間組織

為了評估FIG墨水打印支架在增強心肌細胞的細胞內(nèi)和細胞間組織,、肌原纖維組織和排列的能力，作者將新生大鼠心室心肌細胞（NRVM）接種在打印的二維（2D）FIG支架上。結(jié)果得到高度排列的心臟組織的形成,，相對于多形性培養(yǎng)條件保留了相當?shù)募毎�活��,。接下來作者通過計算取向順序參數(shù)(OOP)來測量結(jié)構(gòu)組織的各向異性程度，該參數(shù)量化了肌聚體 α-肌動蛋白和細胞骨架肌動蛋白絲(F -肌動蛋白)排列,。細胞內(nèi)和細胞間骨架結(jié)構(gòu)產(chǎn)生的預(yù)應(yīng)力決定了細胞核的伸長和取向,，與對照Gel-Alg支架上的細胞核相比，F(xiàn)IG支架上的細胞核被拉長,，NRVM的核取向也沿打印方向排列(0°),，而Gel-Alg支架的核取向無特異性取向。

圖3 多向各向異性心臟組織的機電耦合動力學

為了測試FIGs誘導心肌細胞沿纖維結(jié)構(gòu)自組織并形成心臟功能合胞體的能力,，作者測量細胞-細胞連接結(jié)構(gòu)的功能后果及其電生理特性,。作者使用光學作圖來測量鈣(Ca2+)瞬態(tài)傳播，作為相對于打印方向沿縱向和橫向軸的心臟脈沖傳導的指標,。最后結(jié)果表明,，F(xiàn)IG支架上的心臟組織在6厘米的蛇形圖案上傳播Ca2+波，顯示出沿打印方向的強大電耦合,。利用NRVM和人誘導多能干細胞源性心肌細胞(hiPSC-CMs)在FIG支架上構(gòu)建心臟組織的橫縱傳播速度值分別為1.67±0.085和1.62±0.18,。相比之下，沒有纖維的對照支架上的NRVM組織的傳播速度比接近1,。心肌細胞沿打印方向的優(yōu)先機電耦合使其在電刺激下產(chǎn)生循環(huán)變形,，在一個支架中交替排列方向也表明心肌細胞組織遵循局部纖維方向，導致相應(yīng)的局部組織收縮模式,。

圖4 基于人類干細胞的組織工程,，三維心室模型的結(jié)構(gòu)、電生理和收縮特性

作者在3D打印的心室支架上培養(yǎng)NRVM和hiPSC-CMs,，纖維呈圓周排列,，形成三維心室形狀的層狀各向異性心臟組織。體外心室模型在培養(yǎng)中保持14天,，自發(fā)心跳率為每秒~0.71次,。這表明該支架在超過80萬次的機械載荷循環(huán)中是耐用的，沒有明顯的退化,。作者在對NRVM培養(yǎng)的腦室模型進行點電刺激后,，觀察到Ca2+在橫向(打印方向)的瞬時傳播速度比縱向更快。這證實了3D打印腦室支架中的脈沖傳播也沿著組織排列發(fā)生,，這是由打印方向決定的,。為了評估hiPSC-CM心室模型的收縮性能，作者使用粒子成像測速 (PIV) 測量了基底開口處的流體動力學輸出,，粒子流的方向和速度使能夠估計收縮和松弛期間流體運動的質(zhì)量通量,。最后計算出hiPSC-CM 培養(yǎng)心室模型的心室容積在峰值收縮和峰值舒張之間的變化為5.94±1.66%，比先前報道的NRVM和hiPSC-CM體外心室模型的數(shù)值(射血分數(shù))分別高出2-5倍和8-20倍。

結(jié)論：作者展示了用基于水凝膠的FIG墨水3D打印組織工程心室模型的能力,，該模型同時再現(xiàn)了心臟的微結(jié)構(gòu)ECM結(jié)構(gòu)和宏觀結(jié)構(gòu)器官水平幾何形狀,。注入明膠纖維在水凝膠墨水中充當流變改性劑，能夠在不使用犧牲浴的情況下打印復(fù)雜的3D物體,。這些纖維還提供生化和微觀結(jié)構(gòu)線索，促進細胞粘附和自組織成為功能性合胞體,。這項工作表明FIG墨水打印將在促進標準化和可訪問的生物打印過程中發(fā)揮重要作用,，以微結(jié)構(gòu)精度再現(xiàn)天然器官幾何形狀。

原文鏈接：https://doi.org/10.1038/s41563-023-01611-3