微流控氣泡發(fā)生器與數(shù)字光處理平臺（DLP）用于3D多孔生物支架打印

來源： 生物打印與再生工程

3D打印多孔支架的多孔特性使支架具有增強細胞增殖、擴散,、遷移以及細胞分化能力的功能,，也提高了營養(yǎng)物質(zhì)的運輸或細胞代謝物的去除的效率。但目前常用的犧牲微球法因為涉及溶解犧牲物的多個步驟,，具有耗時,、靈活性差等問題，也限制了孔尺寸的靈活可控性,。而微流控芯片能夠以更簡單,、更快、更可控的方式生產(chǎn)多孔結(jié)構(gòu),�,；�于以上原因，越來越多的研究正在基于微流控原理開發(fā)生產(chǎn)多孔結(jié)構(gòu)的新技術(shù),。

近年來,，已有學者將微流控芯片與擠出式打印機結(jié)合，雖然該方法操作簡單,，但在制造具有復(fù)雜內(nèi)部架構(gòu)和外部形狀的體積結(jié)構(gòu)時,，效率往往較低。Yu Shrike Zhang教授團隊選用基于閥門的流量聚焦（vFF）芯片和具有快速交聯(lián)的優(yōu)勢的3D數(shù)字光處理（DLP）打印平臺相結(jié)合，從孔隙生成的大小,、2D與3D打印的復(fù)雜度,，支架的生物相容性等方面證實了這項結(jié)合技術(shù)有望增強天然多孔組織的模仿特性。

圖1 工作中使用的主要組件（A）VFF芯片（B）DLP平臺

一,、表面活性劑的選擇
表面活性劑可以降低空氣-液體界面的表面張力,，防止氣泡破裂或合并，確保一致的打印質(zhì)量和材料特性,。因此,，該團隊首先測試了三種表面活性劑（Rhamnolipids、CTAB,、Lecithin）對氣泡的穩(wěn)定性的影響,。結(jié)果表明在0.5%（w/v）和5%（w/v）的濃度下，Rhamnolipids的泡沫穩(wěn)定性最差,。相比之下,，CTAB在5%（w/v）的濃度下比Lecithin的穩(wěn)定效果更好，但0.5%（w/v）的情況下相反,。由于Lecithin穩(wěn)定作用的濃度較低,，進一步降低了其潛在的細胞毒性，且在5分鐘即大多數(shù)情況的足夠打印時間內(nèi)表現(xiàn)最好,，因此Lecithin被選為本實驗所用的表面活性劑,。該團隊隨后進行了濃度梯度實驗（0%、0.5%,、1%,、3%或5%（w/v），最終選用了1%濃度Lecithin作為最終的表面活性劑選擇,。

二,、VFF芯片控制氣泡大小的參數(shù)設(shè)定探究
VFF芯片的結(jié)構(gòu)如下圖所示，孔口寬度可以通過改變閥門驅(qū)動（valve channel actuation）的壓力大小來控制,。在本研究中,，該團隊通過改變以下三個要素：墨水流速（Flow rate），氣體通入壓力（Pg）和閥門驅(qū)動的壓力大�,。≒v）探究了VFF芯片生成氣泡的大小范圍,。

圖2 VFF芯片的通道示意圖

首先，該團隊探究了閥門驅(qū)動的壓力大�,。≒v）和孔口寬度之間的函數(shù)關(guān)系,。結(jié)果顯示兩者服從反S形函數(shù)關(guān)系，在大氣壓力下,，孔口寬度約為100μm,。在2.3bar的壓力下,，孔完全關(guān)閉并在>2.5bar的壓力下斷裂。

接著,，該團隊控制Pv為大氣壓強,，探究了墨水流速（Flow rate）和氣體通入壓力（Pg）對于氣泡生成的影響。結(jié)果表明氣體通入壓力以及墨水流速的不同組合可用于產(chǎn)生直徑均勻,、標準差小且尺寸可調(diào)的氣泡，大小從211μm至747μm不等,。

之后,，該團隊改變閥門驅(qū)動的壓力大小Pv試圖進一步縮小產(chǎn)生的氣泡的尺寸，打破前述的平均約211μm的下限,。結(jié)果顯示,，氣泡尺寸隨著壓力Pv的增加而減小，呈非線性關(guān)系,，氣泡最小縮小至143μm,。同時，該團隊還成功測試了三種參數(shù)的各種組合來證明不同條件下泡沫生成的穩(wěn)健性,。

上述實驗結(jié)果證明在vFF芯片內(nèi)生成過程中氣泡的大小能夠得到控制,，不同工藝參數(shù)的變化范圍從143μm到747μm。

圖3 VFF芯片中不同參數(shù)下孔徑狀態(tài)及氣泡大小

三,、2D打印的可行性驗證
光引發(fā)劑可以引起化學交聯(lián),，是實現(xiàn)2D和3D打印性的重要試劑。因此,，該團隊對 LAP（phenyl-2,4,6-trimethylbenzoylphosphonate) 進行了濃度梯度實驗（0.2%,、0.4%、1%（w/v）,，最終選用了1%濃度LAP用于進一步實驗,。在405納米光下曝光時間不到15秒即可實現(xiàn)堅固和可重復(fù)的交聯(lián)。

該團隊對不同復(fù)雜程度的幾何形狀進行了打印,，使用的是一套共同的工藝參數(shù)——油墨配方為7.5%（w/v）fGelMA,，1%（w/v）卵磷脂，1%（w/v）LAP,；flow rate=650μL min-1,；pg = 1.3 bar；pv =大氣壓力,。實驗結(jié)果證明工藝參數(shù)不需要根據(jù)幾何形狀進行優(yōu)化,，且印刷時間與結(jié)構(gòu)本身的復(fù)雜性無關(guān)。

之后,，該團隊使用明場顯微鏡采集并展示了可以精確調(diào)整氣泡直徑的2D打印,。通過使用50μL min-1的恒定體積流量,，變化區(qū)間為100至250mbar的Pg，變化區(qū)間為0至2.25bar的pv,，以2D打印了平均直徑為112 ± 7,、198 ± 7、239 ± 19,、361 ± 17和424 ± 17微米的氣泡并繪制了直方圖,。需要注意的是在這些實驗中使用vFF芯片產(chǎn)生的氣泡平均最大直徑可達424微米，而vFF芯片內(nèi)最大的氣泡平均直徑可達747微米,。該團隊認為可以歸因于芯片外部的氣泡不再被芯片的高度壓縮,，因此變成三維圓形，減少直徑,；此外,，較大的氣泡一旦處于芯片外的大氣壓力下，往往會不太穩(wěn)定,，這在一定程度上導(dǎo)致了氣泡的破裂,。

最后，該團隊測試了2D氣泡梯度打印的能力,，以更好的實現(xiàn)在3D梯度打印的需求,。團隊使用了直接適用于vFF芯片的快速數(shù)字控制，因此可以連續(xù)不中斷的打印氣泡,。大型氣泡是用50μL min-1的flow rate和pg = 250 mbar和pv =大氣壓力制備的,；中型氣泡的壓力降低到pg = 100 mbar；小型氣泡壓力pv額外增加到2.25bar,，以縮小vFF芯片的孔口,。在墨水交聯(lián)后，團隊觀察到高度均勻的圓形氣泡,，其中大部分是六角填充對齊,。

綜上，該團隊研究結(jié)果證明,，該設(shè)備可以在參數(shù)不變的情況下打印復(fù)雜幾何結(jié)構(gòu)并在其中生成大小可控的氣泡,。同時，它具有梯度連續(xù)打印的能力,。

圖4

四,、3D打印的可行性驗證
該團隊通過使用自上而下的DLP打印機，進行了復(fù)雜程度遞增的幾何形狀的3D打印,。并且驗證了將打印結(jié)構(gòu)在細胞培養(yǎng)基中浸泡14天后其結(jié)構(gòu)完整性仍然能夠維持,，而不會出現(xiàn)明顯的變形。同時,，團隊也指出了如空間分辨率較低和打印結(jié)構(gòu)表面不平整等一些缺陷,。

之后,，該團隊使用共聚焦熒光顯微鏡與羅丹共軛fGelMA檢查了多孔結(jié)構(gòu)的空間結(jié)構(gòu)。分析顯示孔隙呈最密六邊形排列,，且大多數(shù)生成的孔隙已經(jīng)在3D排列中相互連接,。之后該團隊對小、中,、大孔徑的樣本進行了μCT重建,，這些結(jié)構(gòu)相比于共聚焦熒光顯微鏡的結(jié)果顯示孔隙度有所減少，該團隊也給出了他們的猜想：一方面,，在3D打印時,，打印過程中表面張力和其他操作可能導(dǎo)致形成缺陷，導(dǎo)致泡沫墨水中的氣泡不完全緊密包裝,。另一方面，在μCT掃描準備樣品期間的處理可能導(dǎo)致結(jié)構(gòu)受到外部力量的影響,。

綜上,，該團隊證明，盡管3D打印還存在一些缺陷,，但生成的多孔結(jié)構(gòu)是精確可調(diào)節(jié)的,。3DDLP打印方法能夠生產(chǎn)具有良好均勻性、范圍更廣泛可實現(xiàn)直徑以及更可控和更快的工藝的孔徑,。

表1 3D打印的最終參數(shù)匯總

圖5 驗證3D可打印性的打印結(jié)構(gòu)

五,、細胞相容性的測試
當涉及到組織工程和再生醫(yī)學的應(yīng)用時，3D打印的多孔水凝膠結(jié)構(gòu)與種子細胞的細胞相容性對于組織替換至關(guān)重要,。在此基礎(chǔ)上,，團隊通過各種染色方法對細胞活力、增殖,、遷移和傳播進行了定性研究,。

細胞首先在3D打印的多孔結(jié)構(gòu)中培養(yǎng)了14天，并在1,、3,、7、10和14天進行活/死檢測以及F-肌動蛋白/核染色,。在整個14天的栽培期中,，團隊觀察到死細胞的百分比都很低，同時,，也在培養(yǎng)過程中發(fā)現(xiàn)細胞從聚集成簇變?yōu)閿U散到占據(jù)支架的大部分,。根據(jù)以上的實驗，團隊證明了支架具有良好的生物相容性,。

圖6 支架細胞相容性的實驗測試

總結(jié)
該實驗了將自上而下的DLP打印機與基于閥門的流量聚焦（vFF）芯片結(jié)合,，建立了強大的打印流程,，并使用細胞染色分析進行了細胞相容性測試，結(jié)果表明,，多孔結(jié)構(gòu)可以在14天內(nèi)支持細胞生長,、擴散、增殖和遷移,。由于其物理化學特性,，fGelMA作為DLP打印的油墨材料受到青睞。在材料選擇中,，選擇了7.5%（w/v）的水溶液fGelMA溶液,，1%（w/v）的卵磷脂作為表面活性劑，1%（w/v）的LAP濃度作為光引發(fā)劑,。同時,，團隊通過調(diào)整油墨流量和氣體壓力、閥門大小,，實現(xiàn)了對氣泡尺寸的控制,，當前研究顯示的均勻直徑從大到747微米到小到143微米不等�,？傮w而言,，該實驗成功地在水凝膠基質(zhì)中生成了可調(diào)大小的均勻氣泡，以制造細胞兼容的多孔支架,。

參考文獻
(Philipp Weber, Ling Cai et al. 2023)

Philipp Weber, Ling Cai, Francisco Javier Aguilar Rojas, Carlos Ezio Garciamendez-Mijares et al. Microfluidic bubble-generator enables digital light processing 3D printing of porous structures, Aggregate, 2023.

https://doi.org/10.1002/agt2.409