華西口腔郭維華IJB：利用擠出式3D打印構(gòu)建HERS-DPCs/GelMA支架促進牙槽骨再生

來源： EFL生物3D打印與生物制造

赫特維希上皮根鞘（HERS）,，是牙發(fā)育過程中內(nèi)釉上皮和外釉上皮向根尖方向生長形成的雙層上皮結(jié)構(gòu),，HERS內(nèi)側(cè)是牙乳頭細胞（DPCs）,，在牙根發(fā)育過程中,，HERS可誘導DPCs分化為成牙本質(zhì)細胞,，后者參與根部牙本質(zhì)的形成。然而,，HERS僅在牙根發(fā)育的特定時期短暫出現(xiàn),，原代HERS細胞數(shù)量少、不易獲取,，常規(guī)的二維培養(yǎng)環(huán)境容易使其上皮特性丟失,，從而失去誘導間充質(zhì)細胞分化的功能。如何維持HERS的上皮特性,，充分發(fā)揮上皮間充質(zhì)間的相互作用，是牙及其支持組織再生研究的一個難點,。

最近,，四川大學華西口腔醫(yī)院的郭維華教授團隊基于擠出式3D生物打印技術(shù)利用GelMA水凝膠重組SD大鼠來源的HERS細胞和DPCs，并通過體內(nèi)實驗來驗證HERS-DPCs/GelMA支架的成骨能力,。相關(guān)論文“3D-bioprinted Recombination Structure of Hertwig’s Epithelial Root Sheath Cells and Dental Papilla Cells for Alveolar Bone Regeneration”發(fā)表在International Journal of Bioprinting雜志上,，第一作者為唐慧琳碩士，通訊作者為郭維華教授。

該研究的總體思路是根據(jù)牙發(fā)育過程中HERS和DPCs的空間位置關(guān)系設(shè)計“層狀結(jié)構(gòu)”模型,，以GelMA水凝膠為支架材料,，通過擠出式3D打印技術(shù)構(gòu)建HERS-DPCs/GelMA結(jié)構(gòu)，并將支架植入SD大鼠的牙槽窩缺損,，驗證該支架產(chǎn)生礦化組織,、促進牙槽骨缺損修復的能力，為牙相關(guān)組織工程和上皮-間充質(zhì)相互作用研究提供新思路,。

首先,，研究人員從SD大鼠乳鼠牙胚中獲取HERS細胞和DPCs，光鏡下觀察到HERS細胞成團生長,，形狀如鋪路石,，DPCs則呈長梭形。免疫熒光染色結(jié)果顯示：上皮細胞標志物CK14和間充質(zhì)細胞標志物Vimentin在HERS細胞中均呈陽性表達,，提示HERS細胞已發(fā)生上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化,，同時具有上皮和間充質(zhì)細胞的特性（圖1，A）,。

然后,，用10% w/v的GelMA溶液分別重懸HERS細胞和DPCs，獲得細胞密度約為1×106/ml的生物墨水用于3D打印,。該研究利用擠出式3D打印機的兩個打印頭,，可實現(xiàn)兩種生物墨水的組合式打印，如先打印一層HERS細胞,，接著打印兩層DPCs,，制備HERS-DPCs立體層狀結(jié)構(gòu)，同樣大小含單一細胞的立體結(jié)構(gòu)作為對照,�,；�/死細胞染色實驗的結(jié)果顯示，在培養(yǎng)后的第1,、4和7天,，GelMA支架中活細胞比例均在80%以上，證明GelMA有優(yōu)異的生物相容性,，適宜細胞的生長（圖1,，B和C）。

圖1 HERS細胞的分離,、培養(yǎng),、鑒定和活力

為了進一步探究HERS-DPCs/GelMA支架中兩種細胞的相互作用，研究人員利用熒光染料DiO和DiL分別將DPCs和HERS細胞標記為綠色和紅色,，并在共聚焦顯微鏡下于三維打印后的第0,、3和8天進行觀察,，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，第8天時,，兩種細胞發(fā)生遷移,，二者的界限也變得模糊（圖2）。

圖2 體外HERS-DPC相互作用

光鏡和掃描電鏡的結(jié)果表明,，3D打印的立體層狀結(jié)構(gòu)呈網(wǎng)格狀,，孔隙均勻，直徑約為0.8 mm,。從培養(yǎng)后的第3天開始,，細胞從GelMA支架中爬出，并大量增殖,，第4天時的細胞匯合度高達80%,，表明此時的細胞生長狀態(tài)良好。隨后,，研究人員通過SD大鼠的牙槽窩移植實驗評估HERS-DPCs/GelMA支架的骨再生效果,。該實驗分為5個組，分別為空白組,、HERS細胞（3D）組,、DPCs（3D）組、HERS-DPCs（3D）組和HERS-DPCs混合組,，空白組不植入任何材料,，HERS-DPCs混合組是將兩種細胞直接與GelMA水凝膠混合，不進行3D打印,。選取8周齡的雌性SD大鼠,，拔除右上頜第一、第二磨牙,，然后用牙科種植機預備牙槽窩,，將樣本植入后嚴密縫合（圖3）。

圖3 打印結(jié)構(gòu)的顯微觀察及牙槽窩移植

觀察8周后取材進一步分析,。HE,、Masson染色結(jié)果顯示各組手術(shù)區(qū)域均有新形成的膠原纖維，空白組的纖維相對更少,、更薄,。免疫組化染色結(jié)果表明：DPCs（3D）組和HERS-DPCs（3D）組的成骨相關(guān)標志物（COL-I、OCN,、RUNX-2）均有陽性表達,，且HERS-DPCs（3D）組有明顯的新骨生成（圖4）。

圖4  8周后通過HE染色,、Masson染色及免疫組化染色評價牙槽骨種植情況

該研究基于擠出式3D生物打印利用GelMA重組HERS細胞和DPCs，并通過牙槽窩移植實驗驗證重組結(jié)構(gòu)的成骨性能。研究結(jié)果表明GelMA具有優(yōu)異的生物相容性,，有利于細胞增殖,、遷移等活動。3D打印的方式最大程度地模擬體內(nèi)牙發(fā)育過程中的微環(huán)境,，構(gòu)建的HERS-DPCs共培養(yǎng)結(jié)構(gòu)中,，HERS細胞和DPCs發(fā)生遷移，植入SD大鼠牙槽窩缺損后有利于牙槽骨再生,。該研究為牙源性上皮-間充質(zhì)相互作用的研究提供了新策略,。

文章來源：
http://doi.org/10.18063/ijb.v8i3.512