利用明膠和脫細胞骨顆粒組成的生物墨水進行細胞打印

來源： EFL生物3D打印與生物制造

生物制造應用面臨的主要挑戰(zhàn)之一是如何獲得能在可打印性,、形狀保真度,、細胞活力和組織成熟度之間取得平衡的生物墨水,。脫細胞方法可以提取天然細胞外基質(zhì)，保留組織特異性基質(zhì)蛋白,。然而,，骨骼脫細胞的關(guān)鍵挑戰(zhàn)在于如何保留有機成分（膠原蛋白、蛋白聚糖）和無機成分（羥基磷灰石）,，以保持骨骼的天然成分和功能,。此外，有必要研究脫細胞骨（DB）顆粒作為一種基于組織的添加劑在生物墨水配方中的作用,，以開發(fā)功能性生物墨水,。

來自土耳其伊茲密爾理工學院的Aylin Kara Özenler 團隊與來自德國埃爾朗根-紐倫堡大學的Aldo R Boccaccini團隊評估了在含有明膠（GEL）和前成骨細胞（MC3T3-E1）或人間充質(zhì)干細胞（hTERT-MSCs）的生物墨水配方中加入不同大�,。ā�45 和 ≤100 μm）和濃度（1%、5%,、10%（重量百分比））的脫細胞骨顆粒的效果,。此外，本研究還提出了一種使用明膠,、DB 顆粒和細胞的簡易生物墨水配方,，其制備過程簡單，細胞存活率高,。本研究對油墨的打印性能進行了評估,。此外，還通過剪切稀化和觸變性測試確定了流變特性,。生物打印結(jié)構(gòu)經(jīng)過 28 天的培養(yǎng),。使用生化分析和熒光顯微鏡評估了細胞的活力、增殖和成骨分化能力,。DB 顆粒的加入增強了細胞增殖和成骨分化能力,，這可能是由于 DB 顆粒含有天然膠原蛋白和羥基磷灰石。使用 DB 粒子后,，堿性磷酸酶活性顯著增加,，特別是在沒有誘導細胞成骨的情況下。此外,，熒光圖像顯示了細胞與材料之間明顯的相互作用以及細胞在結(jié)構(gòu)內(nèi)部的附著,。有了這些充滿希望的結(jié)果，目前的簡易生物墨水配方被認為是骨組織工程的潛在候選材料,，它是一種可用于臨床的材料,，制備簡單，細胞活性高,。相關(guān)工作以題為“3D bioprinting of mouse pre-osteoblasts and human MSCs using bioinks consisting of gelatin and decellularized bone particles”的文章發(fā)表在2024年03月13日的國際知名期刊《Biofabrication》,。

1. 創(chuàng)新型研究內(nèi)容

本研究的目的是開發(fā)一種由凝膠、DB 顆粒和細胞組成的最小化生物墨水配方,，并評估凝膠基質(zhì)中不同大小和濃度的 DB 顆粒對細胞行為的影響,。研究示意圖如圖 1 所示。在之前的研究中,，發(fā)現(xiàn) DB 粒子和 GEL 組合作為生物材料墨水對 MC3T3-E1 前成骨細胞有利,。本研究用小鼠前成骨細胞（MC3T3-E1）和人端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶修飾的間充質(zhì)干細胞（hTERT-MSCs）測試了 GEL/DB 復合生物墨水配方。在凝膠基質(zhì)中加入了不同大小和濃度的 DB 粒子,，以獲得可打印的配方,，同時增強細胞的行為。正如本研究之前所報道的，100 微米的顆粒大小會降低較高顆粒濃度下的可打印性,，因此,，本研究的假設是，減小顆粒大小可能會增加可打印性,，而且細胞行為也會隨著 DB 顆粒濃度的增加而增加,。因此，本研究在兩種不同細胞類型的生物墨水配方中評估了不同大小的 DB 粒子的效果,。通過與 mTG 交聯(lián),，3D生物打印結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性得以保持。在為期 28 天的培養(yǎng)過程中,，對所有3D生物打印細胞負載 GEL/DB 構(gòu)建物的細胞相容性,、生物活性和成骨分化進行了評估。

圖1 研究示意圖

【流變特性】

本研究對 GEL 和 DB 嵌入式 GEL 生物材料油墨的流變特性進行了評估,，以模擬與打印工藝相關(guān)的油墨流動條件,。每組都進行了剪切稀化試驗，通過將剪切速率從 0 s-1 增加到 100 s-1 來測量粘度,。圖 2A 顯示,，所有生物材料油墨的粘度都隨著剪切速率的增加而降低，這表明所有材料都表現(xiàn)出適合擠壓式 3D 打印的剪切稀化行為,。在剪切速率為 10 s-1 時,，GEL 的粘度被測定為 74 Pa.s，與加入 DB 粒子的組相比,，差異具有統(tǒng)計學意義（圖 2（B））,。此外,，添加不同大小和濃度的 DB 粒子也會影響粘度,。經(jīng)測定，GEL/1 DB（100 μm）,、GEL/5 DB（100 μm）,、GEL/5 DB（45 μm）和 GEL/10%DB （45 μm）的粘度分別為 91.70、111.61,、123.84 和 170.67 Pa.s,，在統(tǒng)計學上存在顯著差異（圖 2(B)）。與 100 μm 的 DB 顆粒相比,，45 μm 的 DB 顆粒增加了油墨的粘度,，其統(tǒng)計差異表明較小的顆粒尺寸增強了流變特性。值得注意的是,，如圖 2（B）所示,，摻入 10% DB 顆粒的油墨粘度更高。這可能是由于油墨內(nèi)部顆粒之間的相互作用,。當復合油墨配方中的固體顆粒之間的相互作用被剪切力破壞時,，就會出現(xiàn)剪切變稀的行為,。油墨靜止時的粘度較高，這是由懸浮顆粒之間的相互作用重新組織決定的,，從而提供了形狀穩(wěn)定性,。因此，較小尺寸的 DB 顆粒濃度越高,，懸浮顆粒之間的相互作用就越密集,，從而導致粘度越高。此外,，在本研究團隊之前的研究中,，本研究發(fā)現(xiàn)較高的 DB 粒子濃度（>5%）會降低可打印性，而另一方面,，高濃度的 DB 粒子有助于細胞生長,。本研究發(fā)現(xiàn)較小尺寸的 DB 粒子在較高濃度下會增強流變特性，這也是本研究的假設之一,。

圖2 油墨和 3D 打印水凝膠的流變特性及打印性能評估

【3D 打印 GEL/DB 支架】

本研究對 GEL 和 GEL/DB 油墨的可打印性進行了評估,。光鏡圖像顯示了用轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶交聯(lián)后不同大小和濃度的3D打印 GEL 和 GEL/DB 水凝膠（圖 2(D)）。水凝膠被制成圓柱形,，具有交替的 0°/90°支桿結(jié)構(gòu),，從而在支桿之間形成方形大孔。3D打印的 GEL 和 GEL/DB 水凝膠顯示出具有方形孔幾何形狀的良好打印結(jié)構(gòu)（圖 2(D)）,。所有墨水都很容易打印,，特別是較小尺寸（45 微米）、較高濃度的 DB 粒子有利于打印,，這可能是均勻分布在 GEL 基質(zhì)中的懸浮較小 DB 粒子之間相互作用的結(jié)果,。盡管純 GEL 水凝膠具有透明度，但顆粒濃度越高,，GEL/DB 水凝膠的濁度越高（圖 2(D)）,。所有組的打印適性因子（Pr）都是通過公式（1）計算得出的。Pr < 1 表示油墨凝膠不足,，孔角呈圓形,；Pr = 1 表示凝膠適當，孔幾何形狀呈理想的方形,；而 Pr > 1 則表示油墨過度凝膠,。所有組的 Pr 因子都接近 1。含有 5%DB 的 GEL 組顯示出較低 Pr 因子（Pr = 0.9 ± 0.04）的圓形孔幾何形狀,，與純 GEL 水凝膠相比,，本研究發(fā)現(xiàn)了統(tǒng)計差異（圖 2（E））。根據(jù)之前的報道，當 Pr 因子在 0.9 和 1.1 之間時,，3D打印水凝膠會顯示出適當?shù)墓尚螒B(tài),。因此，5% 的 DB 粒子（100 微米大�,。�會降��3D打印性能,，而 5%的 DB 粒子（45 微米大小）則顯示出最佳打印性能,。此外,，5% 的 DB 粒子（粒徑為 45 微米）的 Pr 系數(shù)為 0.9，具有足夠的打印能力和形狀保真度,。與純 GEL 組相比,，將顆粒尺寸減小到 45 微米可提高 5% DB 組的可打印性，但在統(tǒng)計上沒有差異,。

【生物打印的 MC3T3-E1 前成骨細胞負載 GEL/DB 構(gòu)建物】
本研究成功制作了負載 1% GEL/DB 構(gòu)建物的 MC3T3-E1 前成骨細胞,，并在細胞培養(yǎng)期間用光學顯微鏡觀察了細胞在構(gòu)建物內(nèi)的分布和定位情況。圖 3 顯示了 GEL 和 GEL/DB 結(jié)構(gòu)以及 TCP（組織培養(yǎng)聚苯乙烯）對照組內(nèi)部的細胞光鏡圖像,。在生物打印之前,，制備了含有 MC3T3-E1 的2D鑄造 GEL 和 GEL/DB 水凝膠，以觀察水凝膠中的細胞,。由于 GEL 水凝膠是完全透明的,，因此不易分辨水凝膠的邊緣。如圖 3(A)所示,，GEL 和 GEL/DB 水凝膠中的細胞都是可見的,，7 d 后可觀察到附著和伸長的細胞（圖 3(A)）。此外,，還觀察到細胞附著在 GEL/DB 水凝膠中的 DB 顆粒上（圖 3（A））,。在3D生物打印樣品中，MC3T3-E1 細胞分布在 GEL 和 GEL/1% DB 構(gòu)建物中,，并且在細胞培養(yǎng)期間不斷增殖（圖 3(B)）,。此外,，如圖 3（C）中的放大圖片所示,，14 天后，細胞遷移到結(jié)構(gòu)表面,，并完全覆蓋了3D生物打印結(jié)構(gòu),。GEL水凝膠在 14 天后會降解，并開始在細胞培養(yǎng)基中失重,，這在之前的報道中已有提及,。由于 GEL 開始降解，細胞可以在 3D 打印的結(jié)構(gòu)中找到空間并在結(jié)構(gòu)中遷移。在培養(yǎng)期間,，隨著結(jié)構(gòu)的降解和細胞的增殖,，細胞遷移到結(jié)構(gòu)外，并在細胞培養(yǎng)板上觀察到細胞,，如放大圖像所示（圖 3(C)）,。此外，GEL 的特定 RGD 序列允許細胞在整個培養(yǎng)期間粘附和增殖,，這證明了 GEL 和 GEL/DB 生物墨水配方的細胞相容性,。

圖3 充滿細胞的2D鑄模和3D生物打印結(jié)構(gòu)的光學顯微鏡圖像

在3D生物制造結(jié)構(gòu)中，保持細胞活力和3D打印結(jié)構(gòu)的形狀保真度或穩(wěn)定性是一個重要的關(guān)鍵因素,。因此,，在培養(yǎng)期間對3D生物打印結(jié)構(gòu)中的 MC3T3-E1 細胞進行活/死染色后，對其存活率進行了觀察,。熒光顯微鏡圖像顯示了活細胞（綠色）,、死細胞（紅色）和細胞核（藍色）（圖 4）。DB 顆粒也因其自發(fā)熒光而顯示為藍色/綠色,。圖像顯示,，MC3T3-E1 細胞在第 7 天時附著在 GEL 和 GEL/DB 構(gòu)建物內(nèi)并保持活力（圖 4(A)）。14 天后,，細胞在結(jié)構(gòu)中附著和擴散得更多,，只觀察到少量死細胞（圖 4(A)）。培養(yǎng) 14 d 后,，DAPI 染色顯示細胞核密集,。此外，2D細胞負載 GEL 和 GEL/DB 水凝膠中的 MC3T3-E1 細胞在第 14 天仍保持活力（圖 4(B)）,�,；�/死染色結(jié)果證實，GEL 和 GEL/DB 墨水配方具有細胞相容性,，不會損害 MC3T3-E1 細胞的活力,。

圖4 MC3T3-E1 細胞的活/死染色結(jié)果

在 28 天的培養(yǎng)期內(nèi)，用 LDH 細胞毒性檢測法評估了油墨可能產(chǎn)生的細胞毒性效應,。在2D細胞培養(yǎng)中,，細胞釋放的細胞外 LDH 水平相似，在 28 天的培養(yǎng)期內(nèi)沒有發(fā)現(xiàn)統(tǒng)計差異（圖 5(A)）,。然而,，3D生物打印組在第 1 天的 LDH 水平明顯更高（圖 5(A)）。早期 LDH 水平較高的原因可能是3D生物打印過程中剪切力導致細胞死亡,。在隨后的培養(yǎng)天數(shù)中,，細胞外 LDH 水平持續(xù)下降,，并具有統(tǒng)計學意義，這表明剩余細胞在后期培養(yǎng)中存活并增殖,。MC3T3-E1 細胞的存活率是根據(jù) WST-8 法測定的細胞代謝活性進行量化的,，數(shù)據(jù)顯示，在整個培養(yǎng)過程中,，各組細胞的存活率都在逐漸增加（圖5(B)）,。此外，3D生物打印 GEL 和 GEL/DB 結(jié)構(gòu)的細胞存活率較高,，與2D澆鑄組相比有顯著的統(tǒng)計學差異,。此外，與其他組相比,，3D生物打印 GEL/DB 結(jié)構(gòu)中的細胞存活率最高（圖 5(B)）,。

【細胞增殖和形態(tài)】

根據(jù) PicoGreen 檢測法對dsDNA 的定量分析，本研究評估了生物打印結(jié)構(gòu)內(nèi)部的細胞增殖情況,。與根據(jù)代謝活性得出的存活率結(jié)果（圖 5(B)）一致,，生物打印結(jié)構(gòu)內(nèi)部的細胞數(shù)量在細胞培養(yǎng)期間逐漸增加（圖 5(C)）。第一天,，生物打印結(jié)構(gòu)中的細胞數(shù)量低于2D澆注水凝膠中的細胞數(shù)量,，這可能是圖 5（A）所示第一天釋放的 LDH 較高的結(jié)果。第一天之后,，2D澆注水凝膠組的細胞數(shù)量在第 7 天有所增加,，然后在整個培養(yǎng)期間保持穩(wěn)定。另一方面,，3D生物打印結(jié)構(gòu)中的細胞在 28 天內(nèi)繼續(xù)增殖,，與2D水凝膠相比，在第 7 天,、14 天和 28 天發(fā)現(xiàn)了顯著的統(tǒng)計學差異,。此外，在第 21 天,，生物打印 GEL/DB 構(gòu)建物中的細胞數(shù)量最多,，與3D打印 GEL 組相比，差異有統(tǒng)計學意義（圖 5(C)）,。根據(jù)細胞毒性,、存活率和增殖調(diào)查，GEL 和 DB 加入 GEL 的生物墨水為生物打印后的細胞生長提供了3D微環(huán)境,，作為一種基于天然的最小化生物墨水配方,，顯示出良好的效果,。

本研究利用熒光顯微鏡評估了3D生物打印結(jié)構(gòu)和2D澆注水凝膠內(nèi)的細胞粘附性和細胞形態(tài),。DAPI 和 F-Actin 染色分別顯示 MC3T3-E1 細胞的細胞核（藍色）和細胞骨架（綠色）,。顯微鏡圖像顯示了2D鑄造和3D生物打印結(jié)構(gòu)的細胞粘附情況，以及培養(yǎng) 28 天后細胞與材料的相互作用（圖 5(D)）,。2D澆鑄組在第 28 天顯示了細胞與材料的相互作用,，細胞覆蓋了 DB 嵌入 GEL 水凝膠內(nèi)的 DB 顆粒表面（圖 5(D)）。在3D生物打印 GEL/DB 組中,，細胞覆蓋了結(jié)構(gòu),，顯示出與 DB 粒子非常積極的相互作用，此外,，細胞在第 28 天覆蓋了孔區(qū)域,，這可以從放大圖像中看到（圖 5(D)）。

圖5 細胞在 GEL 和 GEL/DB 構(gòu)建物內(nèi)生長

【評估不同大小和濃度的 DB 粒子對負載 hTERT-間充質(zhì)干細胞的3D生物打印 GEL/DB 構(gòu)建物的細胞行為的影響】

本研究對3D生物打印結(jié)構(gòu)內(nèi)的細胞存活率通過活/死染色進行了評估,。熒光顯微鏡圖像顯示,，在 28 天的培養(yǎng)期間，細胞在 GEL 和 GEL/DB 構(gòu)建物內(nèi)存活和生長（圖 6）,。此外,，由于膠原纖維的自發(fā)熒光，DB 顆粒顯示出藍色,。第一天,，在所有組中都觀察到大量存活細胞（綠色），并檢測到細胞集群,，特別是在 DB 結(jié)合的結(jié)構(gòu)中,。由于顆粒密度高且具有自發(fā)熒光，hTERT-間充質(zhì)干細胞在第一天并不清晰可見,。然而,，大面積的綠色染色，尤其是在 10%的 DB 組中,，表明結(jié)構(gòu)內(nèi)形成了細胞簇（圖 6）,。7 天后，細胞開始在生物打印結(jié)構(gòu)中伸長和擴散,，之后細胞在 28 天的培養(yǎng)期內(nèi)保持活力并不斷增殖,。hTERT 間充質(zhì)干細胞的擴散良好，培養(yǎng) 28 d 后觀察到細胞完全覆蓋,。此外,，活細胞的密度在所有培養(yǎng)日都很高。即使在第 28 天也很難發(fā)現(xiàn)死細胞（紅色）,，這表明油墨配方具有細胞相容性,，較高的 DB 粒子濃度有助于細胞生長。

圖6 3D生物打印 GEL 和 GEL/DB 復合結(jié)構(gòu)中 hTERT-MSC 細胞第 14 天的活/死染色結(jié)果

生物打印后,，使用 LDH 細胞毒性檢測法對墨水材料的潛在細胞毒性進行量化,。將含有細胞的結(jié)構(gòu)培養(yǎng) 28 天,，在每個時間點對細胞培養(yǎng)上清液中的細胞外 LDH 釋放量進行量化。結(jié)果顯示,，在整個培養(yǎng)過程中,，各組的 LDH 水平都保持穩(wěn)定，沒有增加,。各時間點和各組之間沒有發(fā)現(xiàn)統(tǒng)計學差異,，這表明含有 GEL 成分的 DB 對 hTERT-間充質(zhì)干細胞沒有細胞毒性作用（圖 7(A)）。正如在 GEL 構(gòu)建物中加入兔 DB 粒子（圖 4 和圖 5）所顯示的那樣,，牛 DB 粒子對 hTERT-MSC 也沒有細胞毒性作用,。

圖7 生物打印 GEL/DB 構(gòu)建物內(nèi) hTERT-MSC 細胞的生物活性

本研究利用共聚焦顯微鏡詳細評估了3D生物打印結(jié)構(gòu)內(nèi)部的細胞形態(tài)和細胞附著情況。細胞核（藍色）和細胞骨架（綠色）分別采用 DAPI 和 F-Actin 染色（圖 8）,。此外,，由于 DB 顆粒中纖維膠原的自發(fā)熒光，結(jié)構(gòu)內(nèi)部的 DB 顆粒也清晰可見（呈紅色/粉紅色）,。圖像顯示,，細胞在第 28 天時在3D生物打印結(jié)構(gòu)內(nèi)部生長和增殖（圖 8）。細胞在 GEL 和 GEL/DB 構(gòu)建物內(nèi)附著并伸長,，所有組中都能看到細胞覆蓋的趨勢,。值得注意的是，在含有 10% DB 的 GEL 構(gòu)建物中觀察到了更大的細胞網(wǎng)絡以及與 DB 顆粒的良好互動,。這種細胞粘附性表明,，細胞與 GEL/DB 組中均勻分布的 DB 顆粒進行了理想的相互作用。

圖8 3D生物打印 GEL 和 GEL/DB 構(gòu)建物內(nèi)生長的 hTERT 間充質(zhì)干細胞在培養(yǎng)第 28 天時的共聚焦顯微鏡圖像

2. 總結(jié)與展望
本研究展示了一種由 GEL,、DB 顆粒和 MC3T3-E1 前成骨細胞或 hTERT-MSCs組成的最小化生物墨水配方,。本研究的主要方法是利用骨組織的天然 ECM 成分，并確定顆粒的理想濃度,，以獲得更好的細胞反應,。本研究中使用的 DB 顆粒不僅含有膠原纖維，還含有羥基磷灰石,，而現(xiàn)有研究同時使用了脫細胞和脫礦物質(zhì)過程,，這導致骨的生物礦化特性被削弱。此外,，本研究還提出了基于 GEL 的 mTG 交聯(lián)（一種已獲 FDA 批準的材料）簡約生物墨水配方,，與使用多種改性劑或化學成分的復雜水凝膠系統(tǒng)相比，這種配方可以直接制備,，而這些改性劑或化學成分可能會產(chǎn)生細胞毒性,，也無法用于臨床。


文章來源：
https://iopscience.iop.org/article/10.1088/1758-5090/ad2c98