如何利用功能性墨水設計和生物3D打印技術來實現(xiàn)半月板損傷修復,？

來源： EngineeringForLife

半月板損傷是運動醫(yī)學領域面臨的一大挑戰(zhàn),，常因膝關節(jié)受力分布異常,、潤滑降低及穩(wěn)定性下降導致軟骨退化，最終可能發(fā)展為骨關節(jié)炎,。由于半月板自愈能力弱,，修復難度大，現(xiàn)有治療如移植,、切除或縫合術無法根本阻止疾病進程,。這突顯出尋找有效治療手段的緊迫性。隨著組織工程技術的發(fā)展,，為半月板損傷的修復與重建提供了新的思路,，尤其是在復制半月板自然異質性方面的探索，成為當前研究的重點,。

本期,，EFL以發(fā)表在雜志《Chemical Engineering Journal》上的“Regional specific tunable meniscus decellularized extracellular matrix (MdECM) reinforced bioink promotes anistropic meniscus regeneration”研究為例，介紹了3D打印技術結合復合型墨水構建,，可制備具有分區(qū)微結構的支架,，以促進半月板再生和軟骨保護。該支架模擬了半月板的自然異質性,，通過特定區(qū)域的細胞分化和外基質沉積,，實現(xiàn)了各自區(qū)域功能的顯著增強，促進了各向異性的半月板再生,，表明該方法在運動醫(yī)學領域中具有潛在的應用價值,。

1. 本文生物墨水是如何制備的？

➢ GelMA/HAMA水凝膠的配制

利用10%（w/v）的甲基丙烯�,；�明膠（GelMA）和2%（w/v）的甲基丙烯�,；�透明質酸（HAMA）配制光交聯(lián)水凝膠：將GelMA粉末溶于磷酸鹽緩沖液（PBS）并加熱至完全溶解，隨后加入HAMA粉末和0.5%（w/v）的光引發(fā)劑（LAP）,，混合均勻,。


➢ MdECM整合與生物活性因子添加
將半月板脫細胞外基質（MdECM）粉末以2%（w/v）的比例加入到GelMA/HAMA混合物中，以實現(xiàn)區(qū)域特定的細胞誘導,。為了進一步促進特定區(qū)域的細胞分化,，向內部區(qū)域的生物墨水中添加10 ng/mL的轉化生長因子β3（TGF-β3），向外部區(qū)域的生物墨水中添加100 ng/mL的結締組織生長因子（CTGF）,。

➢ 生物墨水的優(yōu)化
通過調整GelMA和HAMA的比例,、MdECM的加入量、以及生物活性因子的濃度,，優(yōu)化生物墨水的物理和化學性質,。這些參數(shù)的精確控制，旨在提高生物墨水的凝膠化性能,、粘度和最終構件的機械強度,，以適應不同的三維打印需求和生物學應用,。

2. 如何利用載缺氧預處理的軟骨祖細胞的GelMA微球治療骨關節(jié)炎？

圖1 本文的研究示意圖

1）光交聯(lián)生物墨水的制備與表征
本文首先從豬半月板中成功提取了區(qū)域特定的MdECM,。實驗對半月板內外區(qū)域進行了分離和脫細胞處理,，旨在去除細胞成分同時保留外基質結構和重要成分如膠原蛋白和糖胺聚糖（GAGs）。隨后,，通過凍干和研磨過程,，將處理后的組織轉化為細小的MdECM粉末。該過程不僅驗證了脫細胞方法的有效性,，還確保了保留了半月板內外區(qū)域的生物化學特性和生物活性,，為后續(xù)生物墨水的制備和半月板組織工程的應用奠定了基礎。

圖2 區(qū)域特異性的MdECM制備和表征

2）區(qū)域特異性MdECM生物油墨的制備與表征
作者基于MdECM開發(fā)了一種模擬半月板自然異質性的生物墨水,。通過將來自半月板內外不同區(qū)域的MdECM與GelMA和HAMA水凝膠結合,，制備了四種不同濃度的MdECM基生物墨水（G10H0, G10H1, G10H2, 和G10H3），旨在發(fā)現(xiàn)最適合細胞生長和精確3D打印的配比,。不同配比的水凝膠在紫外線照射下30秒內能夠快速凝膠化,，且隨著MdECM的加入，墨水由透明轉為不透明,，這一變化可能有助于提高細胞附著和生長,。通過FTIR分析，確認了生物墨水中GH和MdECM成分的均一性和結構穩(wěn)定性,，特別是在870 cm-1處觀察到的C-OH鍵伸展峰,，表明了成功的材料混合。

流變學性質的評估表明,，所有生物墨水都展現(xiàn)出剪切稀化行為,，這對于通過3D打印技術精確構建支架結構極為重要。特別地,，G10H3組表現(xiàn)出更高的彈性模量,，指示其可能更適合支撐細胞生長的結構。此外,，CTGF和TGF-β3的緩慢且持續(xù)的釋放曲線強調了這些生物墨水能夠長時間在細胞微環(huán)境中提供生長因子,，促進特定類型的細胞分化。通過對支架的微觀結構設計,，模擬了半月板的自然微結構,，其中外部區(qū)域的纖維設計為松散和大孔徑,，而內部區(qū)域的纖維緊密且孔徑較小,，有助于模擬半月板內外不同區(qū)域的物理和生物功能。

圖3 區(qū)域特異性MdECM生物墨水的表征

3）區(qū)域特異性生物墨水增強支架的生物學評價
作者進行了區(qū)域特異性生物墨水增強支架的生物學評價,。細胞活力測試的結果顯示,，無論是外部還是內部區(qū)域的生物墨水,，都沒有顯示出細胞毒性，證明了這些生物模擬生物墨水具有滿意的細胞相容性,。為了成功復制半月板的自然形態(tài)和各向異性結構,，向細胞環(huán)境中提供適當?shù)男盘枺�包括生化刺��,，是至關重要的,。研究發(fā)現(xiàn)，TGF-β3能夠提高軟骨基因（如COL2A1,、ACAN和SOX9）的表達水平,，而CTGF能夠在正確刺激下增加纖維軟骨基因（如COL1A1、FN1和TNC）的表達水平,。此外,，通過組織特異性熒光標記的分析顯示，與對照組（PG組）相比,，PGEF組在內部區(qū)域展現(xiàn)了更高水平的II型膠原（Col II）表達,，在外部區(qū)域展現(xiàn)了更高水平的I型膠原（Col-I）表達。實時定量聚合酶鏈反應（q-PCR）的結果進一步證明了在PGEF組中,，無論是軟骨基因（COL II,、ACAN和SOX 9）還是纖維生成基因（COL I、FN1和TNC）的表達都顯著高于對應的對照組,。結果表明,，所開發(fā)的生物模擬水凝膠具有明顯的組織特異性調節(jié)活動，能夠成功模擬軟骨和纖維生成微環(huán)境,。因此,，PGEF被證實具有誘導間充質干細胞進行各向異性纖維軟骨分化以及體外特定區(qū)域細胞外基質生成的能力。

圖4 區(qū)域特異性生物墨水增強支架的生物相容性

4）評價再生半月板對軟骨的保護作用
➀體內再生半月板的宏觀觀察,、MRI和生物力學評價
該研究進行了半月板再生的評估,，在將特定區(qū)域的MdECM增強構造體植入兔膝關節(jié)后進行的。通過使用MRI分析在冠狀面和矢狀面上評估各個組中的組織形態(tài)生成,。結果顯示,，在24周時所有組都可見到新生半月板，PGEF組顯示的再生組織在形狀和輪廓上更接近自然半月板,。此外,，PGEF組的WORMS評分顯著低于其他組，類似于自然半月板,，從而突顯出PGEF支架的卓越再生效果,。再生構造體的一般形態(tài)在24周后展現(xiàn)，其中PGEF組展示了更完整,、更均勻的再生半月板,，與關節(jié)整合性更好,。

為了評估力學的各向異性，進行了各種拉伸測試,，包括內外區(qū)域的徑向和周向的減小和雙向拉伸測試,，并分析了前角和后角的最終拉伸強度。在進行了24周的體內測試后,，觀察到PGEF組展現(xiàn)了特定區(qū)域（內部與外部）在周向拉伸模量和減少模量方面的差異,。然而，就減少模量和雙向拉伸模量而言,，PGEF組與自然組在兩個區(qū)域之間不再存在差異,。此外，PGEF組的徑向拉伸和最終拉伸強度超過了對照組,，更類似于自然組,。

圖5 體內再生半月板的宏觀觀察、MRI和生物力學評價

➁體內再生半月板的組織學評價
進一步實驗表明,，PGEF組的組織學評估顯示了更具區(qū)域特異性的細胞表型和細胞外基質沉積分布,，這與自然半月板非常相似。內部區(qū)域展示了由COL-2和蛋白多糖組成的軟骨基質,，而外部區(qū)域顯示了以COL-1為特征的排列有序的纖維基質,。半定量研究和免疫組化揭示了從外部區(qū)域到內部區(qū)域COL 1的強度降低，而COL 2的強度相應增加,。這種生化組成與自然半月板相似,，其中外部區(qū)域主要是COL-1，而內部區(qū)域的膠原蛋白大部分是COL 2,。PGEF組再生的半月板組織的組織學結果顯示了特定區(qū)域的細胞表型,，類似于自然半月板的ECM的各向異性組織，相比之下,，對照組沒有顯示出差異性的細胞結構,。此外，PGEF組的內部區(qū)域有許多球形的軟骨細胞樣細胞,，而外部區(qū)域則以梭形的成纖維細胞樣細胞為主,，從而類似于半月板的自然結構。

圖6 體內再生半月板的組織學評價

5）區(qū)域特異性MdECM基半月板增強結構對軟骨的保護作用
同時,，研究也討論了再生半月板對軟骨的保護效果,。通過對關節(jié)軟骨的整體觀察，與其他組相比,，PGEF組在每個時間點上顯示出較少的軟骨退化,，這一點也得到了組織學檢查的支持。具體來說，在對照組中,，股骨髁和脛骨平臺的關節(jié)軟骨顯示出相當大的失序，并在甲苯胺藍染色和SO染色中顯現(xiàn)淺色,。根據(jù)國際軟骨修復學會（ICRS）評分和曼金斯評分,，對照組的軟骨損傷更為嚴重。相反,，PGEF組展示出比對照組更優(yōu)越的軟骨保護能力,，根據(jù)組織學染色，PGEF組中沒有明顯的軟骨退化和裂縫,。這些發(fā)現(xiàn)表明,，特定區(qū)域的MdECM增強支架不僅實現(xiàn)了生物功能的各向異性仿生學，而且還促進了機械恢復,。

圖7 體內軟骨的組織學評估

3. 本文的創(chuàng)新點
本研究的主要創(chuàng)新在于開發(fā)了一種基于區(qū)域特定脫細胞外基質（MdECM）的生物墨水,，結合GelMA和HAMA水凝膠制備過程。這種生物墨水不僅模擬了半月板的自然異質性,，而且通過精確控制生物活性因子TGF-β3和CTGF的釋放,，創(chuàng)新地促進了特定區(qū)域細胞的特化分化。此外,，研究首次利用三維打印技術與MdECM相結合,，精確構建了模擬自然半月板結構和功能的組織工程支架，為復雜組織的再生和修復提供了新策略,。

4. 總結
本研究成功證明了MdECM基GelMA/HAMA生物墨水在模擬半月板自然異質性和促進特定細胞分化方面的有效性,。通過結構穩(wěn)定性和打印性能的優(yōu)異表現(xiàn)，以及生物活性因子的長期穩(wěn)定釋放,，這種生物墨水為半月板損傷的修復和再生醫(yī)學領域提供了有力的材料基礎,。體外實驗進一步驗證了其在促進細胞特定類型分化和組織再生方面的潛力，展示了利用三維打印技術精確構建半月板組織工程支架的前景,。

文獻來源：
https://doi.org/10.1016/j.cej.2023.145209