具有工程納米晶域的 3D 打印水凝膠作為功能性血管結(jié)構(gòu)

來源： EFL生物3D打印與生物制造

3D打印（3DP）水凝膠基血管構(gòu)建物已經(jīng)作為對受損血管或器官功能的一種響應(yīng)而得到研究,，通過精確復(fù)制3D結(jié)構(gòu)幾何形狀以接近其功能,。然而,，它們?nèi)匀幻媾R固有的脆弱性挑戰(zhàn),，這無法承受縫合線的穿刺，并且在與血液直接接觸時(shí)無法保持長期結(jié)構(gòu)和功能穩(wěn)定性,。

來自華南理工大學(xué)的施雪濤等團(tuán)隊(duì)報(bào)告了使用基于聚乙烯醇（PVA）的墨水進(jìn)行高保真數(shù)字光處理（DLP）3D打印水凝膠基血管構(gòu)建物,，隨后通過工程化納米晶體域和后續(xù)表面修飾來增強(qiáng)機(jī)械強(qiáng)度。所制備的高精度水凝膠血管構(gòu)建物被賦予了高度期望的機(jī)械強(qiáng)度,、縫合耐受性,、抗膨脹性、抗血栓性和長期通暢性,。值得注意的是,，具有精確瓣膜結(jié)構(gòu)的水凝膠基仿生靜脈移植物在控制單向流動(dòng)方面表現(xiàn)出色，并在4周內(nèi)植入比格犬深靜脈中成功實(shí)現(xiàn)了生物學(xué)功能和通暢性,，從而證實(shí)了其在治療慢性靜脈功能不全方面的有希望的潛力。相關(guān)工作以題為“3D-Printed Hydrogels with Engineered Nanocrystalline Domains as Functional Vascular Constructs”的文章發(fā)表在2024年09月04日的期刊《ACS Nano》,。

      

1.創(chuàng)新型研究內(nèi)容
聚乙烯醇（PVA）具有規(guī)則結(jié)構(gòu)和靈活的分子鏈,，使得可以通過結(jié)晶來定制PVA水凝膠的力學(xué)性能,。此外，羥基的易于功能化,，加上其出色的生物相容性和血液相容性,，使其成為制造具有所需性能的血管構(gòu)建物的理想材料。本文報(bào)告了通過DLP 3D打印大分子前體油墨來制造水凝膠基血管構(gòu)建物的方法,，該油墨由縮水甘油甲基丙烯酸酯功能化PVA（PVAGMA）組成,，隨后用堿溶液處理以工程化納米晶體域，從而產(chǎn)生具有精細(xì)三維結(jié)構(gòu),、優(yōu)異韌性,、機(jī)械強(qiáng)度、抗膨脹性和縫合耐受性的3DP水凝膠構(gòu)建物（圖1a）,。根據(jù)制備步驟,，本文將它們命名為堿處理光固化PVA（AP-PVA）水凝膠。通過用生物活性模式（如含有Arg-Gly-Asp（RGD）肽的明膠）功能化水凝膠表面,，AP-PVA水凝膠基構(gòu)建物被賦予了顯著改善的內(nèi)皮化潛力,，因此在體內(nèi)血液相容性。這一系列出色的性能之前尚未在同一系統(tǒng)的3DP水凝膠材料中同時(shí)報(bào)道過（圖1b,c）,。此外,，本文的方法能夠構(gòu)建各種結(jié)構(gòu)復(fù)雜的可植入血管構(gòu)建物，如多分支移植物和小尺寸血管網(wǎng)絡(luò)等,。通常,，所制備的仿生瓣膜靜脈移植物（BVVGs）擁有與天然靜脈瓣膜相當(dāng)?shù)慕Y(jié)構(gòu)和功能的瓣膜，可以進(jìn)一步用于替換功能受損的深靜脈（圖1d）,。本文創(chuàng)建水凝膠血管構(gòu)建物的方法可以根據(jù)不同的臨床需求進(jìn)行定制,，可能會(huì)為有效的血管功能修復(fù)解決方案的持續(xù)發(fā)展做出貢獻(xiàn)。   

圖1 納米晶體工程化的3D打印水凝膠用于構(gòu)建結(jié)構(gòu)復(fù)雜的血管構(gòu)建物

通過納米晶體域工程實(shí)現(xiàn)機(jī)械強(qiáng)度的3D打印PVA基水凝膠
圖1a展示了制備具有納米晶體域工程的3DP水凝膠（即AP-PVA水凝膠）的過程,。為了使PVA鏈可光交聯(lián)以用于DLP 3D打印,，首先通過與縮水甘油甲基丙烯酸酯的化學(xué)反應(yīng)將聚合物鏈功能化�,？梢匀菀撰@得具有不同分子量（Mw）和取代度（DOS）的PVAGMA,。對于相同的Mw（75 kDa）的PVA，低DOS（例如0.35%）可能導(dǎo)致機(jī)械性能弱的P-PVA水凝膠,，這些水凝膠在3D打印過程中無法支撐結(jié)構(gòu),。過度的化學(xué)交聯(lián)（例如DOS為0.8%）可能限制鏈的移動(dòng)性和規(guī)律性，這也不適合后續(xù)的晶體域工程,。另一方面,，增加分子量可以促進(jìn)在較低的交聯(lián)比率下進(jìn)行凝膠化和隨后的結(jié)晶；然而，這可能伴隨著不利的打印因素,，如粘度升高（圖2a）,。最終，優(yōu)化了用于DLP 3D打印的PVAGMA油墨水溶液,，其Mw為75 kDa,，DOS為0.5%，濃度為9 wt%,，同時(shí)使用5 mg/mL的苯基-2,4,6-三甲基苯甲酰亞膦酸鋰（LAP）作為光引發(fā)劑,，1.0 mg/mL酒石黃作為光吸收劑（圖2a）�,？梢匀菀椎刂圃斐鼍哂懈呓Y(jié)構(gòu)保真度的3DP水凝膠構(gòu)建物,，而后續(xù)的納米晶體域工程可以有效地調(diào)整力學(xué)性能（圖2b）。  

為了探索一種合適的策略來誘導(dǎo)結(jié)晶,，本文采用了不同的方法,，如凍融法、干式退火,、鹽析法和堿處理（即15 wt% NaOH溶液浸泡）,，以增強(qiáng)3DP水凝膠構(gòu)建物的強(qiáng)度。評估了水凝膠的相應(yīng)三維尺寸變化和機(jī)械性能（圖2b,、c）,。盡管干式退火樣品表現(xiàn)出稍高的強(qiáng)度，但不均勻的脫水過程導(dǎo)致尺寸收縮不一致和顯著的結(jié)構(gòu)變形,。與之形成鮮明對比的是,，對于凍融和鹽析處理，很難誘導(dǎo)穩(wěn)定且足夠高的結(jié)晶度,，因此無法實(shí)質(zhì)性地增強(qiáng)3DP水凝膠構(gòu)建物的強(qiáng)度,。值得注意的是，堿處理在確保體積收縮一致的同時(shí)顯著提高了機(jī)械性能（圖2c）,。   

圖2 具有機(jī)械強(qiáng)度的AP-PVA水凝膠構(gòu)建物的3D打印

3D打印基于水凝膠的功能血管構(gòu)建物
基于本文優(yōu)化的制造工藝和機(jī)械強(qiáng)化策略,，可以制造出具有復(fù)雜3D幾何形狀的血管構(gòu)建物。本文最初使用AP-PVA水凝膠在心臟中構(gòu)建了一個(gè)多分叉的主動(dòng)脈弓結(jié)構(gòu),，并開發(fā)了一個(gè)帶有三尖瓣的主動(dòng)脈瓣結(jié)構(gòu),，初步證明了其在防止反向流體流動(dòng)方面的有效性（圖3a）。此外,，人體內(nèi)的小血管結(jié)構(gòu)復(fù)雜,，相應(yīng)的移植物難以制備。本文成功地制造了一個(gè)內(nèi)徑為0.75毫米的血管結(jié)構(gòu),，該結(jié)構(gòu)保持密封,，灌注過程中未觀察到液體泄漏（圖3b）,。這些成就凸顯了本文的方法在定制血管移植物的形狀和大小方面的優(yōu)勢。一些更復(fù)雜的血管系統(tǒng),，如肺血管系統(tǒng),，具有復(fù)雜的血管氣管多尺度拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)，模仿和重建其結(jié)構(gòu)以實(shí)現(xiàn)類似功能仍然很困難,。通過調(diào)整其外部配置，本文將最小表面結(jié)構(gòu)的內(nèi)部通道分為獨(dú)立的和相互交織的兩相空間,。這兩個(gè)空間之間的巨大表面接觸促進(jìn)了氣體-血液相互作用,，這對于構(gòu)建功能性人工肺結(jié)構(gòu)至關(guān)重要。通過向兩個(gè)相鄰?fù)ǖ雷⑷胙鯕夂退�,，本文觀察到輸出水中溶解氧從6.55 mg/L增加到6.75 mg/L,，減慢注水速度進(jìn)一步提高了水中的溶解氧水平（圖3c）。此外,，通過調(diào)整其細(xì)胞大小,，本文設(shè)計(jì)的結(jié)構(gòu)可以增加接觸面積，在1立方厘米的結(jié)構(gòu)內(nèi)達(dá)到高達(dá)15平方厘米的接觸面積（對于9×9個(gè)細(xì)胞）,。這使本文的結(jié)構(gòu)在開發(fā)可植入式人工肺方面具有重要的潛力,。   

圖3 3D打印基于水凝膠的功能血管構(gòu)建物及其體外功能

水凝膠的表面改性與生物相容性
小型血管移植物在長期植入過程中容易形成血栓，導(dǎo)致血管移植物功能失效,，尤其是對于存在瓣膜,、血流較慢（約10 cm/s）的靜脈移植物而言。（54）內(nèi)皮細(xì)胞（EC）層存在于天然血管的內(nèi)襯中,，釋放功能性物質(zhì)以防止血栓形成并分解暫時(shí)形成的血栓,。盡管已經(jīng)開發(fā)了一些含有細(xì)胞的血管構(gòu)建物，但由于倫理問題,、免疫原性問題,、長培養(yǎng)周期和通常不足的機(jī)械性能，它們的臨床應(yīng)用仍然有限,�,？紤]到這些挑戰(zhàn)，開發(fā)一種無細(xì)胞的血管構(gòu)建物,，在植入后能夠在原位內(nèi)皮化,，是一種有前景的替代方案。細(xì)胞毒性測試表明,，AP-PVA水凝膠具有優(yōu)異的體外細(xì)胞相容性,。PVA水凝膠本身就具有出色的低血栓形成性，但它們高度親水且缺乏細(xì)胞粘附位點(diǎn),；因此,，它們不能使EC粘附和擴(kuò)散,。用有利于細(xì)胞粘附的生物活性成分進(jìn)行表面功能化，如含有Arg-Gly-Asp（RGD）肽的明膠,，已被證明是促進(jìn)細(xì)胞粘附的有效策略,。由于涉及到堿處理過程，這些生物活性組分的結(jié)構(gòu)被破壞,，導(dǎo)致細(xì)胞粘附略有改善（圖4b）,。為了解決這一挑戰(zhàn)，本文在堿處理后采用了表面修飾,，即N,N′-碳二咪唑（CDI）介導(dǎo)的化學(xué)錨定（圖4a）,。FTIR光譜中酰胺部分的信號(hào)峰出現(xiàn)、接觸角的表面親水性變化以及與異硫氰酸熒光素（FITC）-明膠相對應(yīng)的綠色熒光的出現(xiàn)共同證實(shí)了明膠成功嫁接到水凝膠構(gòu)建物上,。這種經(jīng)修飾的水凝膠構(gòu)建物簡稱為AP-PVA-G,。EC的粘附顯著改善，導(dǎo)致AP-PVA-G人造血管管內(nèi)壁更加均勻地?cái)U(kuò)散（圖4b,、h）,。此外，免疫熒光測定還表明,，粘附在水凝膠表面的人類臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（HUVECs）和人類血管平滑肌細(xì)胞（HVSMCs）保留了它們的正常表型（圖4f,、g）。   

圖4 3DP水凝膠基構(gòu)建物的表面功能化,，提高了生物相容性

在小獵犬中用于深靜脈置換的生物血管移植物
為驗(yàn)證本文的3DP水凝膠構(gòu)建物作為人造血管移植物替代病變血管的潛力,，通過端對端縫合在小獵犬中進(jìn)行了后肢深靜脈置換。小獵犬腿部的主要靜脈血管與人體中的相似,，包括股靜脈,、隱靜脈和位于肌肉內(nèi)的深靜脈，而原生瓣膜則隨機(jī)分布,。通過術(shù)中X射線血管造影進(jìn)行順行和逆行靜脈造影以評估瓣膜的功能（圖5a,、b）。順行成像結(jié)果顯示,，在3DP水凝膠靜脈植入后,，造影劑成功通過了水凝膠靜脈，表明血管保持通暢,。逆行結(jié)果顯示,，由于植入前沒有瓣膜，造影劑可以滲透到深靜脈中,，這并不意味著存在疾病,，因?yàn)樵谶@種情況下根本沒有瓣膜。然而,，在植入水凝膠血管后,，造影劑的滲透受到限制,，證明了瓣膜的功能（圖5c）。此外,，本文使用超聲波成像監(jiān)測3DP水凝膠血管的通暢性,，在一個(gè)月的植入期間它保持通暢（圖5e）。一個(gè)月植入后,，小獵犬的血液分析結(jié)果保持正常,。免疫熒光染色結(jié)果顯示，粘附在BVVGs內(nèi)部的細(xì)胞表達(dá)了平滑肌細(xì)胞（SMC）特異性標(biāo)志物α-平滑肌肌動(dòng)蛋白（α-SMA）和內(nèi)皮細(xì)胞（EC）特異性標(biāo)志物馮·威爾布蘭因子（VWF）,。這表明在植入一個(gè)月后血管細(xì)胞的粘附和增殖,，展示了在BVVGs上形成內(nèi)皮化層的潛力（圖5d）。這些發(fā)現(xiàn)初步證實(shí)了本文的3DP人造含瓣膜靜脈用于長期深靜脈置換的潛力,。   

圖5 在比格犬深靜脈中植入3DP水凝膠基BVVG（生物血管靜脈移植物）

【總結(jié)與展望】
本文提出了一種策略，通過3D打印基于PVA（聚乙烯醇）的前體油墨來制造機(jī)械強(qiáng)度高的水凝膠基血管構(gòu)建物,，同時(shí)通過引入納米晶體域可以顯著增強(qiáng)其韌性和強(qiáng)度,，從而滿足血管構(gòu)建物的要求，包括高保真度,、結(jié)構(gòu)復(fù)雜性,、機(jī)械強(qiáng)度和血液相容性。體外和體內(nèi)研究已經(jīng)證明了其在功能性血管替代方面的有希望的應(yīng)用,，以及其有利的瓣膜結(jié)構(gòu)能夠精細(xì)調(diào)節(jié)內(nèi)部流動(dòng),，特別是在比格犬深靜脈替換中使用含有3DP仿生瓣膜的靜脈移植物的情況下。因此,，本文的3DP水凝膠構(gòu)建物在臨床個(gè)性化血管移植和血管化器官構(gòu)建研究中具有極大的前景,。更一般地說，這種設(shè)計(jì)和制造平臺(tái)提供了擴(kuò)展創(chuàng)造各種人造組織和器官以供植入的可能性,。   



文章來源：

https://doi.org/10.1021/acsnano.4c08359