生物3D打印技術新突破，實現(xiàn)成骨細胞向骨細胞的高效分化

來源： EFL生物3D打印與生物制造

體外骨模型是研究骨組織行為和細胞響應的重要工具,，尤其在揭示特定骨病理機制和評估新療法效果方面具有關鍵作用,。然而，目前的體外骨模型存在一些局限性,，例如無法完全模擬生理條件下的細胞-基質(zhì)相互作用,，以及在二維培養(yǎng)中無法準確反映骨細胞與其三維細胞外基質(zhì)的復雜相互作用。此外，盡管動物模型提供了三維環(huán)境,，但缺乏對細胞環(huán)境進行精確操控的能力,，且不能完全代表人體組織。

因此,，開發(fā)能夠準確模擬人體骨組織生理特性的三維體外模型迫在眉睫。這一模型需要在三維環(huán)境中包含初級人類細胞,，并準確再現(xiàn)從成骨細胞到骨細胞的整個成骨分化過程,。

針對此問題，來自法國里昂的分子和超分子化學與生物化學研究所Emma Petiot開發(fā)了一種通過生物3D打印技術開發(fā)的體外骨模型,，該模型能夠促進初級人成骨細胞向骨細胞的分化過程,。相關研究以“In vitro bioprinted 3D model enhancing osteoblast-to-osteocyte differentiation”為題發(fā)表在《Biofabrication》上。

本論文有關于生物3D打印骨模型,，主要介紹了利用生物打印技術開發(fā)體外骨模型以促進成骨細胞向骨細胞分化的研究,。

（1）首次在生物打印的人體初級成骨細胞中表達骨細胞特異性蛋白：本研究首次在生物打印的人體初級成骨細胞中檢測到骨細胞特異性蛋白PHEX的表達，這標志著在體外骨模型構建方面的重要進展,。

（2）優(yōu)化水凝膠的力學性質(zhì)以促進成骨細胞分化：通過調(diào)整水凝膠的彈性模量和粘彈性行為,，研究發(fā)現(xiàn)彈性模量為8 kPa且隨時間具有粘彈性行為的水凝膠最適合成骨細胞向骨細胞的分化。

（3）細胞-基質(zhì)相互作用的詳細分析：研究詳細分析了細胞-基質(zhì)相互作用,，包括水凝膠收縮和細胞外基質(zhì)蛋白（如纖維連接蛋白和膠原蛋白I）的分泌,，揭示了細胞如何主動影響其微環(huán)境。

本研究為骨病理研究提供了新的體外模型,，有助于更深入地理解骨細胞分化和骨組織工程,。

1. 生物3D打印骨模型的構建與優(yōu)化
本論文詳細介紹了生物3D打印骨模型的構建與優(yōu)化過程。

研究者首先選擇了由明膠,、藻酸鹽和纖維蛋白原組成的生物墨水,，這種生物墨水已被證明適用于多種細胞類型，包括成骨細胞的增殖,。接著,，通過不同的交聯(lián)溶液調(diào)整生物墨水的力學性質(zhì)，包括彈性模量和粘彈性行為,。具體來說,，研究者測試了三種交聯(lián)條件：TGHCa、TGLCa和TGHDMEM,，每種條件都旨在調(diào)整水凝膠的力學特性以更好地支持成骨細胞分化,。通過動態(tài)力學分析（DMA）和透射電子顯微鏡（TEM）等表征手段，研究者評估了水凝膠的粘彈性和微孔性,。最終,，研究發(fā)現(xiàn)TGLCa條件（彈性模量為8 kPa且具有粘彈性行為）的水凝膠在促進成骨細胞向骨細胞分化方面表現(xiàn)出最佳效果。此外，研究還優(yōu)化了生物打印參數(shù),，如細胞密度和打印幾何形狀,，以確保構建的骨模型能夠準確模擬體內(nèi)骨組織的生理環(huán)境。   

這些優(yōu)化措施顯著提高了骨模型的生物相容性和功能性,，為骨組織工程和骨病理研究提供了新的有力工具,。

圖1 生物打印構建體中成骨細胞的增殖情況

2. 水凝膠力學性質(zhì)對成骨細胞分化的影響
本論文研究了水凝膠力學性質(zhì)對成骨細胞分化的影響。

研究者通過調(diào)整水凝膠的彈性模量和粘彈性行為,，探討了這些力學性質(zhì)如何影響成骨細胞向骨細胞的分化過程,。具體而言，研究者制備了三種不同力學性質(zhì)的水凝膠：TGHCa（高彈性模量和粘彈性行為）,、TGLCa（低彈性模量和粘彈性行為）和TGHDMEM（低彈性模量但彈性行為）,。通過動態(tài)力學分析（DMA）表征水凝膠的力學性質(zhì)，并使用透射電子顯微鏡（TEM）分析水凝膠的微孔性,。結果表明,，TGLCa條件的水凝膠（彈性模量為8 kPa且具有粘彈性行為）最能促進成骨細胞的分化，表現(xiàn)為細胞增殖停止,、堿性磷酸酶活性增加,、樹突發(fā)展和骨細胞標志物PHEX的表達。這一發(fā)現(xiàn)強調(diào)了水凝膠的粘彈性行為和適當?shù)膹椥阅Ａ吭谡{(diào)控成骨細胞分化中的關鍵作用,。此外,，研究還發(fā)現(xiàn)高微孔性的水凝膠能夠改善氧氣和營養(yǎng)物質(zhì)的擴散，進一步促進成骨細胞向骨細胞的分化,。   

這些結果揭示了水凝膠力學性質(zhì)對成骨細胞分化的深遠影響,，為開發(fā)更有效的骨組織工程策略提供了重要依據(jù)。

圖2 生物打印構建體的收縮情況

3. 細胞-基質(zhì)相互作用在骨細胞分化中的作用
本論文探討了細胞-基質(zhì)相互作用在骨細胞分化中的作用,。   

研究者通過生物3D打印技術構建了包含成骨細胞的水凝膠模型,，并分析了細胞如何通過分泌細胞外基質(zhì)蛋白影響其微環(huán)境，從而促進骨細胞分化,。具體來說,，研究者觀察到了成骨細胞在水凝膠中分泌的纖維連接蛋白和膠原蛋白I，這些蛋白是細胞外基質(zhì)的重要組成部分,。通過免疫組織化學染色和透射電子顯微鏡（TEM）分析,，研究者發(fā)現(xiàn)，在TGLCa條件的水凝膠中,，成骨細胞分泌的膠原蛋白I顯著增多,，且水凝膠的收縮現(xiàn)象明顯，這表明細胞-基質(zhì)相互作用在骨細胞分化中起著關鍵作用,。此外,，研究還發(fā)現(xiàn)細胞通過改變水凝膠的微結構來適應其分化需求,，例如在高微孔性的水凝膠中，細胞能夠更好地擴散氧氣和營養(yǎng)物質(zhì),，從而促進骨細胞的成熟和分化,。

這些結果表明，細胞-基質(zhì)相互作用不僅是骨細胞分化的必要條件,，而且可以通過優(yōu)化水凝膠的力學性質(zhì)和微結構來進一步增強這一過程,，為骨組織工程提供了新的見解和策略。   

圖3 成骨細胞分泌的細胞外基質(zhì)蛋白

圖4 細胞外基質(zhì)的超微結構分析   

圖5 成骨細胞形態(tài)的演變

4. 骨細胞特異性蛋白的表達與鑒定
本論文研究了骨細胞特異性蛋白的表達與鑒定在生物3D打印骨模型中的應用,。

研究者通過在優(yōu)化后的水凝膠中培養(yǎng)成骨細胞,，觀察到了骨細胞特異性蛋白PHEX的表達，這是骨細胞成熟的重要標志,。通過免疫組織化學染色,，研究者發(fā)現(xiàn),，在TGLCa條件的水凝膠中,，成骨細胞在培養(yǎng)21天后開始表達PHEX，且隨著時間的推移,，表達量逐漸增加,。此外，研究者還通過堿性磷酸酶（ALP）活性的檢測進一步驗證了骨細胞的分化過程,。ALP是成骨細胞分化的早期標志物,，其活性在成骨細胞向骨細胞分化過程中逐漸降低。研究結果表明,，在TGLCa條件的水凝膠中,，ALP活性在初期增加，隨后穩(wěn)定,，這與骨細胞分化的典型過程一致,。   

這些發(fā)現(xiàn)表明，通過生物3D打印技術構建的骨模型能夠有效促進成骨細胞向骨細胞的分化,，并成功表達骨細胞特異性蛋白,，為骨組織工程和骨病理研究提供了新的實驗平臺。

圖6 堿性磷酸酶（ALP）活性的變化   

圖7 骨細胞特異性蛋白PHEX的表達

綜上所述,，本論文通過生物打印技術構建了包含成骨細胞的3D骨模型,，并研究了不同水凝膠的力學性質(zhì)對成骨細胞分化的影響。研究結果顯示,，成骨細胞在不同水凝膠中表現(xiàn)出不同的增殖和分化行為,，具體體現(xiàn)在細胞形態(tài)、堿性磷酸酶（ALP）活性以及細胞外基質(zhì)的分泌上,。通過透射電子顯微鏡觀察,，細胞外基質(zhì)的超微結構也得到了詳細分析,。此外，論文還通過免疫組織化學染色鑒定了骨細胞特異性蛋白PHEX的表達情況,。本研究揭示了水凝膠力學性質(zhì)在調(diào)控成骨細胞分化中的關鍵作用,，為未來骨組織工程的優(yōu)化提供了重要依據(jù)。

未來可以進一步探索機械刺激和共培養(yǎng)破骨細胞對骨模型成熟度的影響,，以期實現(xiàn)更接近生理狀態(tài)的骨組織工程模型,。此外，通過優(yōu)化水凝膠的力學性質(zhì)和微孔結構,，有望提高骨模型的生物相容性和功能性,，為骨相關疾病的治療提供新的策略和解決方案。   

文章來源：https://doi.org/10.1088/1758-5090/ad8ca6