【解析】骨組織3D打印技術打印，成為骨再生的未來希望

據(jù)報道美國異體骨移植患者的人類免疫缺陷病毒感染率為１／ １６０萬 ,。近些年來人造材料，如羥基磷灰石,、硫酸鈣等已用于骨缺損的填充,，然而實際效果遜于自體或異體骨，為此,，人們正在探索新的途徑和技術來破解骨缺損治療的臨床難題,。３Ｄ打印技術的興起或許可以為解決上述難題帶來希望。

３Ｄ生物打印是組織工程學的一種高速仿形技術,，以計算機三維設計模型為藍本,，利用激光引導、噴墨打 印等技術,，將生物材料通過逐層堆積粘結,，疊加塑型，最終形成仿真的組織或器官。１９９９年,，Ｗｉｎｄｅｒ等 利用ＣＴ掃描并三維重建出顱骨缺損的外形,，并應用３Ｄ打印技術快速打印出合適形狀、大小鈦金屬植入體,，用 于治療患者顱骨缺損并獲得成功,。Ｉｇａｗａ等則利用３Ｄ打印技術成功打印出磷酸三鈣植入骨，修復了狗顱骨缺損部位,。骨組織３Ｄ打印需要合適的聚合材料,，在組織打印過程中能夠保護細胞功能完整，同時保證打印后組織內細胞營養(yǎng)運輸及廢物的排出,。如何構建３Ｄ骨模型,、自然成骨、促進骨愈合,、提高細胞成活率以及減少免疫原性,，成為骨組織３Ｄ打印亟需解決和突破的重要研究課題。綜合現(xiàn)有研究工作和進展,，我們歸納出理想的３Ｄ骨組織打印的雛形：

（１）以骨骼缺損為原型,，以生物可吸收高分子化合物為材料，快速打印出具有骨硬度,、多孔,、利于細胞生長的結構支架；
（２）細胞可黏附于支架并能增殖,、分化成骨,，支架的多孔結構有利于氧氣及營養(yǎng)的供給，有利于骨組織生長及血管新生,，并可避免應力屏蔽效應,；
（３）生物支架可提供細胞生長分化所需的細胞因子，如血管內皮生長因子促進血管新生,、骨形態(tài)發(fā)生蛋白促進細胞增殖分化,，為細胞成骨提供持續(xù)的微環(huán)境。這一技術可能是骨再生最有效的方法,，甚至可能實現(xiàn)完美的骨重建和關節(jié)重塑,。

1.３Ｄ打印骨組織的生物支架
生物支架是３Ｄ骨組織打印的基本框架，需具備易打印性,、與缺損部分的契合性,、良好的生物相容性、骨誘導性,、力學穩(wěn)定性,、可塑性,、生物降解性等特性，目前主要有金屬,、生物陶瓷,、聚合材料、聚合材料與生物陶瓷或金屬與生物陶瓷的復合材料作為備選,。

1.1金屬支架
鈦合金質輕,、強度高且具有優(yōu)良的生物相容性，是理想的植入人體的植入物,。將前成骨細胞種植鈦合金支架上培養(yǎng),，可檢測到纖維連接蛋白、黏著斑蛋白,、細胞數(shù)量,、堿性磷酸酶、細胞外基質鈣化結節(jié)均增加,，顯示 多孔結構的鈦合金支架可促進前成骨細胞黏附,、增殖、分化,、礦化 ,。我們將多孔的３Ｄ打印鈦合金移植物植入羊的Ｃ３－Ｃ５椎體，通過微計算機斷層掃描技術（ｍｉｃｒｏｃｏｍｐｕｔｅｄｔｏｍｏｇｒａｐｈｙ,，Ｍｉｒｏ－ＣＴ）掃描重建及組織染 色均可觀察到大量骨組織長入移植物內,。雖然３Ｄ打印金屬支架生物相容性好、抗壓能力強,，但金屬支架打印需要在高溫條件下進行,，支架打印時不能同步涂層生物活性分子或細胞混合打印。

1.2生物陶瓷支架
生物陶瓷具有抗壓能力強,、生物相容性好,、骨誘導能力強等優(yōu)點，被廣泛用于組織工程研究,。目前主要有磷酸鈣,、磷酸二正硅酸鈣,、雙相磷酸鈣,、硅酸鈣／β－磷酸三鈣等材質的陶瓷支架， 其抗壓強度可達到松質骨生物力學要求,。３Ｄ打印的陶瓷支架可促進細胞成骨性分化和血管新生,。羥基磷灰石支架可促進牙神經(jīng)鞘干細胞成骨性分化，雙相磷酸鈣支架中β－磷酸三鈣的含量增加可促進細胞成骨性 分化,，硅酸鈣／β－磷酸三鈣支架中硅元素釋放可促進成骨樣細胞合成ＢＭＰ－２,、ＴＧＦ－β發(fā)揮成骨作用,。 ＮＡＧＥＬ支架促進人臍靜脈內皮細胞增殖及血管形成。雖然陶瓷支架生物相容性好,、骨誘導能力強,、抗壓性能好，但是陶瓷支架同樣需要高溫下進行打印,，打印時不能 對支架同步涂層促進骨形成的生物活性分子或抗感染的藥物 ,，同時其脆性高、韌性差,、剪切應力弱,。

1.3聚合材料支架
聚合材料具有促進細胞成骨性分化、細胞黏附,、可控降解等優(yōu)點,，亦被廣泛用于組織工程研究，如聚乙二醇,、聚乳酸,、聚己內酯等。聚己內酯支架與骨髓干細胞共打印,，體外研究發(fā)現(xiàn)細胞表達堿性磷酸酶,、骨鈣素、Ⅰ型膠原增加,，將含有人重組骨形成蛋白的聚己 內酯支架植入兔子尺骨中段骨折部位,，觀察到骨量明顯增加，同時支架降解緩慢,。增加支架的粗糙程度可提高細胞的黏附能力,，將聚乙二醇分子上修飾ＲＧＤ及ＰＨＳＲＮ，３Ｄ打印出含有成骨細胞的生物支架體外培養(yǎng),，黏著斑染色觀察到成骨細胞黏附數(shù)目增加,。聚合材料支架在增加新骨生成、促進細胞黏附方面有很大優(yōu)勢,，但是與細胞混合打印的高分子支架抗壓能力較弱,，不能達到人體骨的抗壓要求。同時聚合材料降解產(chǎn)生酸性產(chǎn)物,，降低局部ｐＨ值,，會引起炎癥反應；局部環(huán)境ｐＨ值降低可加速聚合材料酯鍵水解,，促進聚合材料降解,，影響支架生物力學作用。

1.4復合材料支架
為更大程度上滿足３Ｄ骨打印支架的需求,，聚合材料與陶瓷或者金屬與陶瓷混合制成的復合材料支架成為新的突破,。結合陶瓷支架與聚合材料支架的優(yōu)點,，如同骨組織中膠原與鈣鹽的有機結合，更接近真實的 骨基質環(huán)境,，被許多學者用于３Ｄ骨組織打印研究,。聚合材料與陶瓷制成的復合材料抗壓能力增強，接近松質骨力學性能,。β－硅酸鈣／聚乙丙交酯復合支架 體外及在體研究均表現(xiàn)出促進成骨及促進組織血管新生的能力,。在復合材料支架中添加生物活性物質，如ＢＭＰ－２,、ＶＥＧＦ,，可進一步刺激支架內血管、骨量的增加,，因此,，包被生物活性分子的復合材料將成為３Ｄ骨打印支架的最佳選擇。

2.３Ｄ打印骨支架的多孔結構與微環(huán)境
在臨床中大量骨組織移植后,，氧氣及營養(yǎng)供給不足是移植后成活率降低的重要原因之一,。可供植入細胞利用的氧氣在幾小時內就被消耗殆盡,，而局部血管新生傳送氧氣和營養(yǎng)需要幾周的時間,，即植入的大部分細胞在獲得足夠的氧氣和營養(yǎng)之前就可能失去功能或凋亡。３Ｄ打印骨組織的多孔結構可持續(xù)提供氧氣與營養(yǎng),，同時可消除應力屏蔽作用,，且其表面形貌粗糙可促進細胞黏附。

2.1孔徑與孔隙率
３Ｄ打印多孔組織其孔徑大小,、孔隙率及孔徑交聯(lián)度均影響細胞存活,、組織長入。Ｋｕｂｏｋｉ等１９９８年報道了移植物的多孔結構可促進骨再生,，將噴涂有ＢＭＰ－２的實體和多孔的羥磷灰石分別植入大鼠體內,，發(fā)現(xiàn) 實體羥磷灰石表面沒有骨生成，而多孔的羥磷灰石內部有骨生成,。Ｒｏｙ等２００３年發(fā)現(xiàn)將附著有２０％β－磷酸三鈣的聚丙交脂的多孔移植物,，其孔隙率為８０％～８５％，孔徑為１２５～１５０μｍ,，植入兔子的顱骨部位,，發(fā)現(xiàn)形成 骨量較多。Ｋａｒａｇｅｏｒｇｉｏｕ等 ２００５年報道孔徑交聯(lián)可增加營養(yǎng)運輸,、細胞遷移,、細胞橋連及組織長入的能力,。

2.2 血管新生
３Ｄ打印骨內血管的新生會影響組織植入體內后的功能重建,，亦是衡量３Ｄ打印骨組織能否在臨床中應用的重要標準,。骨內脈管系統(tǒng)可供給距離血管１００μｍ以內的組織的氧氣和營養(yǎng)。有學者觀察到將嵌有細 胞的工程骨植入體內,，距離血管１００～２００μｍ范圍內的細胞可獲得營養(yǎng)供應,。也有學者觀察到將孔徑為 ５２３μｍ、孔隙率為７０％的聚己內酯／磷酸鈣支架植入后,，骨缺損部位新生血管明顯增加 ,。還有學者在孔徑為２７５μｍ、４００μｍ的３Ｄ打印支架中均觀察到大量的新生血管,，而支架孔徑為１００μｍ時觀察到新生血管 相對較少 ,，因此不同材料的多孔結構支架中孔徑和孔隙率與打印骨組織內血管新生及新生血管長入的深度密切相關。

2.3促進成骨
３Ｄ打印骨組織的成骨性分化是衡量工程骨優(yōu)劣的主要指標,，多孔結構有利于細胞的增殖,、分化，促進骨組織長入,。明膠共打印羥磷石灰圓柱形多孔支架促進骨原細胞增殖,，且在體研究發(fā)現(xiàn)交聯(lián)孔徑１００～４００μｍ、孔隙率７５％的支架較適合骨原細胞增殖及成骨性分化,。雙向磷酸鈣支架孔徑為３００μｍ時,，促進細胞 增殖能力強于磷酸三鈣支架。目前學者們均認為多孔支架促進成骨,，但孔徑,、孔隙率、交聯(lián)度是多少時最適合成骨,，并沒有統(tǒng)一的標準,，這可能與支架材料不同有關。

3.３Ｄ骨以及其他細胞聯(lián)合打印
３Ｄ細胞打印技術是一種在體外將細胞定植于人造器官的特定位置,、構造三維多細胞體系的技術,。生物體內細胞和細胞外基質按照一定的空間結構排列形成，細胞在細胞外基質中精確定位是維持生物結構,、形態(tài)和功能完整性的必要條件,。３Ｄ骨組織打印將細胞與支架同時打印，利于在支架原位成骨,，實現(xiàn)完美骨再生,。目前用于３Ｄ骨組織打印的細胞主要有骨原細胞、胚胎干細胞,、成體干細胞（脂肪,、骨髓、間質）,、誘導多能干細胞及內皮細胞,。

3.1骨原細胞與內皮細胞共打印
骨原細胞具有成骨性分化能力,，內皮細胞有促進血管新生能力。成骨性細胞與內皮細胞共同打印于３Ｄ組織中,，細胞間通過直接接觸,、縫隙連接、自分泌／旁分泌等途徑,，完成信息交流,，促進血管新生、骨組織形成,。將人真皮微血管內皮細胞與人成骨肉瘤細胞ＭＧ－６３細胞定植于３Ｄ打印骨組織中進行體外培養(yǎng),，觀察到大量微血管樣結構形成，分泌ＶＥＧＦ水平增加,，細胞間粘連分子表達上調,，同時ＭＧ－６３細胞存活時間明顯增加。將ＨＵＶＥＣｓ與人成骨細胞在體外共培養(yǎng),，可檢測到ＶＥＧＦ,、Ⅰ型膠原、粘連分子表達上調,，同時堿性磷酸酶,、骨鈣素、Ｒｕｎｘ－２等成骨性標記表達明顯增加,，但骨原細胞數(shù)量較少,，增殖能力相對較低，不適合大量成骨,。

3.2成體干細胞與內皮細胞共打印
成體干細胞具有多向分化潛能,，且增殖能力比骨原細胞強，可用于３Ｄ骨細胞打印,。骨髓間充質干細胞或脂肪衍生間充質干細胞與ＨＵＶＥＣｓ體外共培養(yǎng)可觀察到微血管樣結構形成,，而ＨＵＶＥＣｓ單獨 培養(yǎng)不能形成微血管樣結構。有學者研究發(fā)現(xiàn)初級成骨細胞與人內皮細胞共培養(yǎng)時,，初級成骨細胞通過產(chǎn)生細胞外基質,、分泌ＶＥＧＦ等，促進內皮細胞衍生的血管新生,。亦有學者發(fā)現(xiàn)ＭＳＣｓ與ＨＵＶＥＣｓ體外共培養(yǎng)時,，ＨＵＶＥＣｓ抑制ＭＳＣｓ增殖及成脂肪性分化，并且ＨＵＶＥＣｓ通過上調ＭＳＣｓ核內β－鏈蛋白（β－ｃａｔｅｎｉｎ）及 ｐＳｍａｄ１／５／８表達,，激活其內源性Ｗｎｔ及ＢＭＰ信號通路,，促進其成骨性分化。盡管干細胞具有多能分化特性，但如何精確調控其定向成骨分化,，并配合血管新生,，依然是該領域尚未解決的重要科學問題。

3.3胚胎干細胞打印
胚胎干細胞具有在體外培養(yǎng)中無限增殖,、自我更新和多向分化的特性，容易誘導成骨,，被許多學者用于３Ｄ骨組織打印,。將人胚胎干細胞培養(yǎng)形成胚胎，取出間質干細胞,，種植在藻酸鹽微粒包被的碳酸鈣支架上,，細胞表達堿性磷酸酶、骨鈣素均增加,，鈣鹽沉積明顯,。若將人胚胎干細胞衍生的間質干細胞，種植在ＲＧＤ修 飾的ＣＰＣ支架中,，可顯著刺激成骨,。胚胎干細雖然有很好的成骨分化特性，但其瘤變率仍無法避免,，同時費用也極其昂貴,，且存在倫理問題。

3.4ｉＰＳＣｓ細胞打印
ｉＰＳＣｓ細胞是通過基因轉染技術將某些轉錄基因導入體細胞內,，使體細胞直接重構成為胚胎干細胞樣的多潛能細胞,。由于胚胎干細胞在醫(yī)學應用上存在免疫排斥以及倫理窘境，學者正在嘗試用ｉＰＳＣｓ細胞代替胚胎干細胞,。將小鼠尾部成纖維細胞重構為ｉＰＳＣｓ細胞,，用轉化生長因子－β１及轉化生長因子－β２處理后，ｉＰＳＣｓ細胞ＲｕｎＸ－２,、ＯＳＸ,、ＯＰＮ、ＯＣＮ基因表達水平增加,，將該細胞種植于羥基磷灰石／碳酸三鈣支架,，在體研究發(fā)現(xiàn)ｉＰＳＣｓ細胞表達骨鈣素增加。將ｉＰＳＣｓ細胞種植在用血漿處理后的聚醚砜支架上,，其表達堿性磷酸酶,、骨鈣素顯著增加，植入大鼠體內發(fā)現(xiàn)骨缺損部位新骨形成量多,，愈合快,。將人骨髓中ＣＤ３４＋細胞用ｐＥＢ－Ｃ５病毒轉染后重構為ｉＰＳＣｓ細胞，培養(yǎng)并種植在磷酸鈣支架上，發(fā)現(xiàn)ｉＰＳＣｓ細胞存活時間長,，ＡＬＰ,、 ＲｕｎＸ－２、Ⅰ型膠原等成骨基因表達水平顯著增加,，骨鹽合成增多,。將含有ＢＭＰ－２基因的慢病毒轉染到ｉＰＳＣｓ－ＭＳＣｓ，種植在碳酸鈣支架上,，顯著促進該細胞成骨性分化及骨鹽形成,。雖然通過病毒轉染添加“重新編程”基因或取代細胞中有缺陷基因的方法可能引起感染，且可能產(chǎn)生細胞瘤變,，但是ｉＰＳＣｓ技術不使用胚胎細胞或卵細胞,，無倫理學問題，同時制備ｉＰＳＣｓ細胞為患者體細胞,，無免疫排斥問題,，且可制備的細胞數(shù)量充足。

4.３Ｄ打印骨組織與生物降解
３Ｄ打印骨組織植入體內促進骨缺損部位功能重建,，在骨骼功能重建過程中細胞產(chǎn)生新的基質代替支架,，最終達到骨組織缺損前的生理狀態(tài)，材料降解最理想的情況是新生基質與材料降解的速度在時間,、空間能夠同步,，且打印組織材料降解不影響骨骼局部生物力學。Ｗａｎｇ等 發(fā)現(xiàn)β－ＣＳ／ＰＤＬＧＡ復合材料支架植 入家兔體內,，在４,、１２、２６周時新骨形成分別是１６．３３％,、２８．７％,、２６．３７％，支架降解率在４,、２０周分別是３３．７１％,、６５．７２％，表明β－ＣＳ／ＰＤＬＧＡ支架不但有骨誘導效應,、促進骨形成,，且該支架降解率更接近新骨形成速度。 Ｗａｎｇ等將骨傳導性好的β－磷酸三鈣與骨誘導性好的β－ＣＳ制成混合型多孔生物陶瓷支架,，植入股骨缺損部位,，發(fā)現(xiàn)β－磷酸三鈣與β－ＣＳ比例為１∶１時，在第４,、１２,、２６周新骨形成量是１９．５４％、３０．００％、２３．５５％,，相應支架降解率分別為１９．４８％,、５２．３６％、６６．８１％,，即該支架降解與新骨形成接近同步,，這樣骨組織形成與支架降解在時間、空間上幾乎同步進行,，能夠促進骨組織局部缺損更快愈合,。

隨著研究的深入，骨組織３Ｄ打印在骨移植方面的潛能受到越來越多學者的關注,，現(xiàn)有的研究已經(jīng)發(fā)現(xiàn)骨組織３Ｄ打印在提供營養(yǎng)和氧氣,、生物力學,、細胞成骨性分化,、支架降解等方面均有重要作用。骨組織３Ｄ打印在骨科具有十分廣泛的應用前景,，例如骨腫瘤切除后骨組織植入,。北京大學第三醫(yī)院已完成世界首例用３Ｄ打印技術人工定制樞椎椎體治療寰樞椎惡性腫瘤的手術，該植入物為用鈦合金粉末３Ｄ打印出的樞椎,，這標志著３Ｄ打印技術已經(jīng)在脊柱外科臨床中應用,。基于上述研究中骨組織３Ｄ打印的優(yōu)點以及研究人員進一步的努力和探索,，骨組織３Ｄ打印將是骨再生的未來,。

編輯：南極熊
作者：鄭 揚，李危石,，劉忠軍 （北京大學第三醫(yī)院骨科）