【解析】骨組織3D打印技術(shù)打印,，成為骨再生的未來希望

據(jù)報道美國異體骨移植患者的人類免疫缺陷病毒感染率為１／ １６０萬 ,。近些年來人造材料,，如羥基磷灰石,、硫酸鈣等已用于骨缺損的填充,，然而實際效果遜于自體或異體骨,，為此,，人們正在探索新的途徑和技術(shù)來破解骨缺損治療的臨床難題。３Ｄ打印技術(shù)的興起或許可以為解決上述難題帶來希望。

３Ｄ生物打印是組織工程學(xué)的一種高速仿形技術(shù),，以計算機三維設(shè)計模型為藍本,，利用激光引導(dǎo)、噴墨打 印等技術(shù),，將生物材料通過逐層堆積粘結(jié),，疊加塑型，最終形成仿真的組織或器官,。１９９９年,，Ｗｉｎｄｅｒ等 利用ＣＴ掃描并三維重建出顱骨缺損的外形，并應(yīng)用３Ｄ打印技術(shù)快速打印出合適形狀,、大小鈦金屬植入體,，用 于治療患者顱骨缺損并獲得成功。Ｉｇａｗａ等則利用３Ｄ打印技術(shù)成功打印出磷酸三鈣植入骨,，修復(fù)了狗顱骨缺損部位,。骨組織３Ｄ打印需要合適的聚合材料，在組織打印過程中能夠保護細胞功能完整,，同時保證打印后組織內(nèi)細胞營養(yǎng)運輸及廢物的排出,。如何構(gòu)建３Ｄ骨模型、自然成骨,、促進骨愈合,、提高細胞成活率以及減少免疫原性，成為骨組織３Ｄ打印亟需解決和突破的重要研究課題,。綜合現(xiàn)有研究工作和進展,，我們歸納出理想的３Ｄ骨組織打印的雛形：

（１）以骨骼缺損為原型，以生物可吸收高分子化合物為材料,，快速打印出具有骨硬度,、多孔、利于細胞生長的結(jié)構(gòu)支架,；
（２）細胞可黏附于支架并能增殖,、分化成骨，支架的多孔結(jié)構(gòu)有利于氧氣及營養(yǎng)的供給,，有利于骨組織生長及血管新生,，并可避免應(yīng)力屏蔽效應(yīng)；
（３）生物支架可提供細胞生長分化所需的細胞因子,，如血管內(nèi)皮生長因子促進血管新生,、骨形態(tài)發(fā)生蛋白促進細胞增殖分化，為細胞成骨提供持續(xù)的微環(huán)境,。這一技術(shù)可能是骨再生最有效的方法,，甚至可能實現(xiàn)完美的骨重建和關(guān)節(jié)重塑,。

1.３Ｄ打印骨組織的生物支架
生物支架是３Ｄ骨組織打印的基本框架，需具備易打印性,、與缺損部分的契合性,、良好的生物相容性、骨誘導(dǎo)性,、力學(xué)穩(wěn)定性,、可塑性、生物降解性等特性,，目前主要有金屬,、生物陶瓷、聚合材料,、聚合材料與生物陶瓷或金屬與生物陶瓷的復(fù)合材料作為備選,。

1.1金屬支架
鈦合金質(zhì)輕、強度高且具有優(yōu)良的生物相容性,，是理想的植入人體的植入物,。將前成骨細胞種植鈦合金支架上培養(yǎng)，可檢測到纖維連接蛋白,、黏著斑蛋白,、細胞數(shù)量、堿性磷酸酶,、細胞外基質(zhì)鈣化結(jié)節(jié)均增加,，顯示 多孔結(jié)構(gòu)的鈦合金支架可促進前成骨細胞黏附,、增殖,、分化、礦化 ,。我們將多孔的３Ｄ打印鈦合金移植物植入羊的Ｃ３－Ｃ５椎體,，通過微計算機斷層掃描技術(shù)（ｍｉｃｒｏｃｏｍｐｕｔｅｄｔｏｍｏｇｒａｐｈｙ，Ｍｉｒｏ－ＣＴ）掃描重建及組織染 色均可觀察到大量骨組織長入移植物內(nèi),。雖然３Ｄ打印金屬支架生物相容性好,、抗壓能力強，但金屬支架打印需要在高溫條件下進行,，支架打印時不能同步涂層生物活性分子或細胞混合打印,。

1.2生物陶瓷支架
生物陶瓷具有抗壓能力強、生物相容性好,、骨誘導(dǎo)能力強等優(yōu)點,，被廣泛用于組織工程研究。目前主要有磷酸鈣,、磷酸二正硅酸鈣,、雙相磷酸鈣,、硅酸鈣／β－磷酸三鈣等材質(zhì)的陶瓷支架， 其抗壓強度可達到松質(zhì)骨生物力學(xué)要求,。３Ｄ打印的陶瓷支架可促進細胞成骨性分化和血管新生,。羥基磷灰石支架可促進牙神經(jīng)鞘干細胞成骨性分化，雙相磷酸鈣支架中β－磷酸三鈣的含量增加可促進細胞成骨性 分化,，硅酸鈣／β－磷酸三鈣支架中硅元素釋放可促進成骨樣細胞合成ＢＭＰ－２,、ＴＧＦ－β發(fā)揮成骨作用。 ＮＡＧＥＬ支架促進人臍靜脈內(nèi)皮細胞增殖及血管形成,。雖然陶瓷支架生物相容性好,、骨誘導(dǎo)能力強、抗壓性能好,，但是陶瓷支架同樣需要高溫下進行打印,，打印時不能 對支架同步涂層促進骨形成的生物活性分子或抗感染的藥物 ，同時其脆性高,、韌性差,、剪切應(yīng)力弱。

1.3聚合材料支架
聚合材料具有促進細胞成骨性分化,、細胞黏附,、可控降解等優(yōu)點，亦被廣泛用于組織工程研究,，如聚乙二醇,、聚乳酸、聚己內(nèi)酯等,。聚己內(nèi)酯支架與骨髓干細胞共打印,，體外研究發(fā)現(xiàn)細胞表達堿性磷酸酶、骨鈣素,、Ⅰ型膠原增加,，將含有人重組骨形成蛋白的聚己 內(nèi)酯支架植入兔子尺骨中段骨折部位，觀察到骨量明顯增加,，同時支架降解緩慢,。增加支架的粗糙程度可提高細胞的黏附能力，將聚乙二醇分子上修飾ＲＧＤ及ＰＨＳＲＮ,，３Ｄ打印出含有成骨細胞的生物支架體外培養(yǎng),，黏著斑染色觀察到成骨細胞黏附數(shù)目增加。聚合材料支架在增加新骨生成,、促進細胞黏附方面有很大優(yōu)勢,，但是與細胞混合打印的高分子支架抗壓能力較弱，不能達到人體骨的抗壓要求,。同時聚合材料降解產(chǎn)生酸性產(chǎn)物,，降低局部ｐＨ值,，會引起炎癥反應(yīng)；局部環(huán)境ｐＨ值降低可加速聚合材料酯鍵水解,，促進聚合材料降解,，影響支架生物力學(xué)作用。

1.4復(fù)合材料支架
為更大程度上滿足３Ｄ骨打印支架的需求,，聚合材料與陶瓷或者金屬與陶瓷混合制成的復(fù)合材料支架成為新的突破,。結(jié)合陶瓷支架與聚合材料支架的優(yōu)點，如同骨組織中膠原與鈣鹽的有機結(jié)合,，更接近真實的 骨基質(zhì)環(huán)境,，被許多學(xué)者用于３Ｄ骨組織打印研究。聚合材料與陶瓷制成的復(fù)合材料抗壓能力增強,，接近松質(zhì)骨力學(xué)性能,。β－硅酸鈣／聚乙丙交酯復(fù)合支架 體外及在體研究均表現(xiàn)出促進成骨及促進組織血管新生的能力。在復(fù)合材料支架中添加生物活性物質(zhì),，如ＢＭＰ－２,、ＶＥＧＦ，可進一步刺激支架內(nèi)血管,、骨量的增加,，因此，包被生物活性分子的復(fù)合材料將成為３Ｄ骨打印支架的最佳選擇,。

2.３Ｄ打印骨支架的多孔結(jié)構(gòu)與微環(huán)境
在臨床中大量骨組織移植后,，氧氣及營養(yǎng)供給不足是移植后成活率降低的重要原因之一�,？晒┲踩爰毎�利用的氧氣在幾小時內(nèi)就被消耗殆盡,，而局部血管新生傳送氧氣和營養(yǎng)需要幾周的時間，即植入的大部分細胞在獲得足夠的氧氣和營養(yǎng)之前就可能失去功能或凋亡,。３Ｄ打印骨組織的多孔結(jié)構(gòu)可持續(xù)提供氧氣與營養(yǎng),，同時可消除應(yīng)力屏蔽作用，且其表面形貌粗糙可促進細胞黏附,。

2.1孔徑與孔隙率
３Ｄ打印多孔組織其孔徑大小、孔隙率及孔徑交聯(lián)度均影響細胞存活,、組織長入,。Ｋｕｂｏｋｉ等１９９８年報道了移植物的多孔結(jié)構(gòu)可促進骨再生，將噴涂有ＢＭＰ－２的實體和多孔的羥磷灰石分別植入大鼠體內(nèi),，發(fā)現(xiàn) 實體羥磷灰石表面沒有骨生成,，而多孔的羥磷灰石內(nèi)部有骨生成。Ｒｏｙ等２００３年發(fā)現(xiàn)將附著有２０％β－磷酸三鈣的聚丙交脂的多孔移植物,，其孔隙率為８０％～８５％,，孔徑為１２５～１５０μｍ,，植入兔子的顱骨部位，發(fā)現(xiàn)形成 骨量較多,。Ｋａｒａｇｅｏｒｇｉｏｕ等 ２００５年報道孔徑交聯(lián)可增加營養(yǎng)運輸,、細胞遷移、細胞橋連及組織長入的能力,。

2.2 血管新生
３Ｄ打印骨內(nèi)血管的新生會影響組織植入體內(nèi)后的功能重建,，亦是衡量３Ｄ打印骨組織能否在臨床中應(yīng)用的重要標(biāo)準(zhǔn)。骨內(nèi)脈管系統(tǒng)可供給距離血管１００μｍ以內(nèi)的組織的氧氣和營養(yǎng),。有學(xué)者觀察到將嵌有細 胞的工程骨植入體內(nèi),，距離血管１００～２００μｍ范圍內(nèi)的細胞可獲得營養(yǎng)供應(yīng)。也有學(xué)者觀察到將孔徑為 ５２３μｍ,、孔隙率為７０％的聚己內(nèi)酯／磷酸鈣支架植入后,，骨缺損部位新生血管明顯增加 。還有學(xué)者在孔徑為２７５μｍ,、４００μｍ的３Ｄ打印支架中均觀察到大量的新生血管,，而支架孔徑為１００μｍ時觀察到新生血管 相對較少 ，因此不同材料的多孔結(jié)構(gòu)支架中孔徑和孔隙率與打印骨組織內(nèi)血管新生及新生血管長入的深度密切相關(guān),。

2.3促進成骨
３Ｄ打印骨組織的成骨性分化是衡量工程骨優(yōu)劣的主要指標(biāo),，多孔結(jié)構(gòu)有利于細胞的增殖、分化,，促進骨組織長入,。明膠共打印羥磷石灰圓柱形多孔支架促進骨原細胞增殖，且在體研究發(fā)現(xiàn)交聯(lián)孔徑１００～４００μｍ,、孔隙率７５％的支架較適合骨原細胞增殖及成骨性分化,。雙向磷酸鈣支架孔徑為３００μｍ時，促進細胞 增殖能力強于磷酸三鈣支架,。目前學(xué)者們均認為多孔支架促進成骨,，但孔徑、孔隙率,、交聯(lián)度是多少時最適合成骨,，并沒有統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)，這可能與支架材料不同有關(guān),。

3.３Ｄ骨以及其他細胞聯(lián)合打印
３Ｄ細胞打印技術(shù)是一種在體外將細胞定植于人造器官的特定位置,、構(gòu)造三維多細胞體系的技術(shù)。生物體內(nèi)細胞和細胞外基質(zhì)按照一定的空間結(jié)構(gòu)排列形成,，細胞在細胞外基質(zhì)中精確定位是維持生物結(jié)構(gòu),、形態(tài)和功能完整性的必要條件。３Ｄ骨組織打印將細胞與支架同時打印,，利于在支架原位成骨,，實現(xiàn)完美骨再生,。目前用于３Ｄ骨組織打印的細胞主要有骨原細胞、胚胎干細胞,、成體干細胞（脂肪,、骨髓、間質(zhì)）,、誘導(dǎo)多能干細胞及內(nèi)皮細胞,。

3.1骨原細胞與內(nèi)皮細胞共打印
骨原細胞具有成骨性分化能力，內(nèi)皮細胞有促進血管新生能力,。成骨性細胞與內(nèi)皮細胞共同打印于３Ｄ組織中,，細胞間通過直接接觸、縫隙連接,、自分泌／旁分泌等途徑,，完成信息交流，促進血管新生,、骨組織形成,。將人真皮微血管內(nèi)皮細胞與人成骨肉瘤細胞ＭＧ－６３細胞定植于３Ｄ打印骨組織中進行體外培養(yǎng)，觀察到大量微血管樣結(jié)構(gòu)形成,，分泌ＶＥＧＦ水平增加,，細胞間粘連分子表達上調(diào)，同時ＭＧ－６３細胞存活時間明顯增加,。將ＨＵＶＥＣｓ與人成骨細胞在體外共培養(yǎng),，可檢測到ＶＥＧＦ、Ⅰ型膠原,、粘連分子表達上調(diào),，同時堿性磷酸酶、骨鈣素,、Ｒｕｎｘ－２等成骨性標(biāo)記表達明顯增加,，但骨原細胞數(shù)量較少，增殖能力相對較低,，不適合大量成骨,。

3.2成體干細胞與內(nèi)皮細胞共打印
成體干細胞具有多向分化潛能，且增殖能力比骨原細胞強,，可用于３Ｄ骨細胞打印,。骨髓間充質(zhì)干細胞或脂肪衍生間充質(zhì)干細胞與ＨＵＶＥＣｓ體外共培養(yǎng)可觀察到微血管樣結(jié)構(gòu)形成，而ＨＵＶＥＣｓ單獨 培養(yǎng)不能形成微血管樣結(jié)構(gòu),。有學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)初級成骨細胞與人內(nèi)皮細胞共培養(yǎng)時，初級成骨細胞通過產(chǎn)生細胞外基質(zhì),、分泌ＶＥＧＦ等,，促進內(nèi)皮細胞衍生的血管新生,。亦有學(xué)者發(fā)現(xiàn)ＭＳＣｓ與ＨＵＶＥＣｓ體外共培養(yǎng)時，ＨＵＶＥＣｓ抑制ＭＳＣｓ增殖及成脂肪性分化,，并且ＨＵＶＥＣｓ通過上調(diào)ＭＳＣｓ核內(nèi)β－鏈蛋白（β－ｃａｔｅｎｉｎ）及 ｐＳｍａｄ１／５／８表達,，激活其內(nèi)源性Ｗｎｔ及ＢＭＰ信號通路，促進其成骨性分化,。盡管干細胞具有多能分化特性,，但如何精確調(diào)控其定向成骨分化，并配合血管新生,，依然是該領(lǐng)域尚未解決的重要科學(xué)問題,。

3.3胚胎干細胞打印
胚胎干細胞具有在體外培養(yǎng)中無限增殖、自我更新和多向分化的特性,，容易誘導(dǎo)成骨,，被許多學(xué)者用于３Ｄ骨組織打印。將人胚胎干細胞培養(yǎng)形成胚胎,，取出間質(zhì)干細胞,，種植在藻酸鹽微粒包被的碳酸鈣支架上，細胞表達堿性磷酸酶,、骨鈣素均增加,，鈣鹽沉積明顯。若將人胚胎干細胞衍生的間質(zhì)干細胞,，種植在ＲＧＤ修 飾的ＣＰＣ支架中,，可顯著刺激成骨。胚胎干細雖然有很好的成骨分化特性,，但其瘤變率仍無法避免,，同時費用也極其昂貴，且存在倫理問題,。

3.4ｉＰＳＣｓ細胞打印
ｉＰＳＣｓ細胞是通過基因轉(zhuǎn)染技術(shù)將某些轉(zhuǎn)錄基因?qū)�入體細胞內(nèi),，使體細胞直接重構(gòu)成為胚胎干細胞樣的多潛能細胞。由于胚胎干細胞在醫(yī)學(xué)應(yīng)用上存在免疫排斥以及倫理窘境,，學(xué)者正在嘗試用ｉＰＳＣｓ細胞代替胚胎干細胞,。將小鼠尾部成纖維細胞重構(gòu)為ｉＰＳＣｓ細胞，用轉(zhuǎn)化生長因子－β１及轉(zhuǎn)化生長因子－β２處理后,，ｉＰＳＣｓ細胞ＲｕｎＸ－２,、ＯＳＸ、ＯＰＮ,、ＯＣＮ基因表達水平增加,，將該細胞種植于羥基磷灰石／碳酸三鈣支架，在體研究發(fā)現(xiàn)ｉＰＳＣｓ細胞表達骨鈣素增加。將ｉＰＳＣｓ細胞種植在用血漿處理后的聚醚砜支架上,，其表達堿性磷酸酶,、骨鈣素顯著增加，植入大鼠體內(nèi)發(fā)現(xiàn)骨缺損部位新骨形成量多,，愈合快,。將人骨髓中ＣＤ３４＋細胞用ｐＥＢ－Ｃ５病毒轉(zhuǎn)染后重構(gòu)為ｉＰＳＣｓ細胞，培養(yǎng)并種植在磷酸鈣支架上,，發(fā)現(xiàn)ｉＰＳＣｓ細胞存活時間長,，ＡＬＰ、 ＲｕｎＸ－２,、Ⅰ型膠原等成骨基因表達水平顯著增加,，骨鹽合成增多。將含有ＢＭＰ－２基因的慢病毒轉(zhuǎn)染到ｉＰＳＣｓ－ＭＳＣｓ,，種植在碳酸鈣支架上,，顯著促進該細胞成骨性分化及骨鹽形成。雖然通過病毒轉(zhuǎn)染添加“重新編程”基因或取代細胞中有缺陷基因的方法可能引起感染,，且可能產(chǎn)生細胞瘤變,，但是ｉＰＳＣｓ技術(shù)不使用胚胎細胞或卵細胞，無倫理學(xué)問題,，同時制備ｉＰＳＣｓ細胞為患者體細胞,，無免疫排斥問題，且可制備的細胞數(shù)量充足,。

4.３Ｄ打印骨組織與生物降解
３Ｄ打印骨組織植入體內(nèi)促進骨缺損部位功能重建,，在骨骼功能重建過程中細胞產(chǎn)生新的基質(zhì)代替支架，最終達到骨組織缺損前的生理狀態(tài),，材料降解最理想的情況是新生基質(zhì)與材料降解的速度在時間,、空間能夠同步，且打印組織材料降解不影響骨骼局部生物力學(xué),。Ｗａｎｇ等 發(fā)現(xiàn)β－ＣＳ／ＰＤＬＧＡ復(fù)合材料支架植 入家兔體內(nèi),，在４、１２,、２６周時新骨形成分別是１６．３３％,、２８．７％、２６．３７％,，支架降解率在４,、２０周分別是３３．７１％、６５．７２％,，表明β－ＣＳ／ＰＤＬＧＡ支架不但有骨誘導(dǎo)效應(yīng),、促進骨形成,，且該支架降解率更接近新骨形成速度。 Ｗａｎｇ等將骨傳導(dǎo)性好的β－磷酸三鈣與骨誘導(dǎo)性好的β－ＣＳ制成混合型多孔生物陶瓷支架,，植入股骨缺損部位,，發(fā)現(xiàn)β－磷酸三鈣與β－ＣＳ比例為１∶１時,，在第４,、１２、２６周新骨形成量是１９．５４％,、３０．００％,、２３．５５％，相應(yīng)支架降解率分別為１９．４８％,、５２．３６％,、６６．８１％，即該支架降解與新骨形成接近同步,，這樣骨組織形成與支架降解在時間,、空間上幾乎同步進行，能夠促進骨組織局部缺損更快愈合,。

隨著研究的深入,，骨組織３Ｄ打印在骨移植方面的潛能受到越來越多學(xué)者的關(guān)注，現(xiàn)有的研究已經(jīng)發(fā)現(xiàn)骨組織３Ｄ打印在提供營養(yǎng)和氧氣,、生物力學(xué),、細胞成骨性分化、支架降解等方面均有重要作用,。骨組織３Ｄ打印在骨科具有十分廣泛的應(yīng)用前景,，例如骨腫瘤切除后骨組織植入。北京大學(xué)第三醫(yī)院已完成世界首例用３Ｄ打印技術(shù)人工定制樞椎椎體治療寰樞椎惡性腫瘤的手術(shù),，該植入物為用鈦合金粉末３Ｄ打印出的樞椎,，這標(biāo)志著３Ｄ打印技術(shù)已經(jīng)在脊柱外科臨床中應(yīng)用�,；�于上述研究中骨組織３Ｄ打印的優(yōu)點以及研究人員進一步的努力和探索,，骨組織３Ｄ打印將是骨再生的未來。

編輯：南極熊
作者：鄭 揚,，李危石,，劉忠軍 （北京大學(xué)第三醫(yī)院骨科）