《AFM》3D 打印 “腸” 奇跡：構(gòu)建三培養(yǎng)管狀網(wǎng)狀人工腸

來源：EFL生物3D打印與生物制造

先天性腸道閉鎖或狹窄等疾病常需手術(shù)干預(yù),，但對于胎兒或兒科患者,，手術(shù)切除可能引發(fā)短腸綜合征，進而需要器官移植,。然而,，胎兒供體短缺限制了器官的可獲取性，因此開發(fā)類器官再生療法和人工器官迫在眉睫,。在人工腸道的研究中,，盡管3D生物打印技術(shù)取得了一定進展，但此前的研究多聚焦于腸道內(nèi)壁部分結(jié)構(gòu)的構(gòu)建或藥物吸收模型的開發(fā),，無法充分模擬天然腸道的完整結(jié)構(gòu)和功能,。已有的方法在容納細胞類型、機械性能以及促進細胞間相互作用等方面存在不足,，難以滿足實際移植需求,。  

來自韓國機械與材料研究所、忠南國立大學(xué)和韓國生物科學(xué)與生物技術(shù)研究所的Seok-jo Yang教授和Junhee Lee教授團隊合作開展研究,。他們利用混合3D打印技術(shù),，構(gòu)建了一種三培養(yǎng)管狀網(wǎng)狀腸道（TTMI），整合了肌成纖維細胞,、內(nèi)皮細胞和上皮細胞,。該團隊通過使用低濃度的明膠甲基丙烯酰（GelMA）生物墨水提高細胞活力，采用雙冷卻模塊改善打印性能,，并運用多頭四軸生物打印機增強支架的機械性能,。相關(guān)工作以“Hybrid 3D-Printed Tri-Cultured Intestine with Tubular Mesh Structure”為題發(fā)表在《Advanced Functional Materials》上，為人工腸道的發(fā)展提供了新的方向,，有望推動組織工程和再生醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的進步,。

研究內(nèi)容
1. 用于TTMI的多頭3D打印系統(tǒng)開發(fā)，通過構(gòu)建先天性腸道閉鎖或狹窄胎兒的人工腸移植模型,，利用多頭四軸可控3D生物打印機及加熱,、冷卻模塊進行實驗，研究了TTMI的設(shè)計,、構(gòu)建過程以及細胞在其中的分布和相互作用,。結(jié)果表明，成功設(shè)計并制備出具有四層結(jié)構(gòu),、包含三種細胞類型的TTMI,，其結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性良好，細胞間能有效相互作用，模擬了天然腸道的部分結(jié)構(gòu)和功能,。

圖1. 用于TTMI的多頭3D打印系統(tǒng)開發(fā),。  

2. PCL管狀網(wǎng)的機械性能，使用萬能測試機和特定夾具對不同網(wǎng)格間距的PCL管狀網(wǎng)進行拉伸測試,，測量其應(yīng)力 - 應(yīng)變曲線,、彈性恢復(fù)率等指標。研究了PCL管狀網(wǎng)的拉伸強度,、屈服強度,、彈性模量以及彈性恢復(fù)率與網(wǎng)格間距的關(guān)系。結(jié)果顯示,，隨著網(wǎng)格間距從0.6mm增加到2.0mm,，拉伸強度、屈服強度和楊氏模量降低,；網(wǎng)格間距為1.0mm和1.2mm時各項性能表現(xiàn)相似,；彈性恢復(fù)率在網(wǎng)格間距為1.0mm時較好，綜合考慮選擇1.0mm網(wǎng)格間距制備管狀網(wǎng),。

圖2. PCL管狀網(wǎng)的機械性能,。  

3. 使用雙冷卻模塊打印低濃度GelMA，運用旋轉(zhuǎn)流變儀測量GelMA的流變特性,，通過COMSOL模擬和實際測量溫度,，研究了不同濃度GelMA在不同溫度下的溶膠 - 凝膠轉(zhuǎn)變行為，以及雙冷卻模塊對低濃度GelMA打印的影響,。結(jié)果表明,，不同濃度GelMA的溶膠 - 凝膠轉(zhuǎn)變溫度不同，雙冷卻模塊能有效維持2%和3% GelMA的凝膠狀態(tài),，確保管狀生物打印的形狀保真度,，并得出了不同濃度GelMA打印的最佳溫度和時間條件。

圖3. 使用雙冷卻模塊打印低濃度GelMA,。  

4. 優(yōu)化GelMA濃度以提高打印性和細胞活力,，將HUVECs和CCD - 18Co細胞分別封裝在不同濃度GelMA中進行打印，利用熒光顯微鏡觀察細胞活性和形態(tài),，通過CCK - 8實驗檢測細胞增殖情況,。研究了不同濃度GelMA對兩種細胞的活力、增殖和分化的影響,。結(jié)果顯示,，2% GelMA有利于HUVECs的增殖和維持形態(tài)，3% GelMA對CCD - 18Co細胞的增殖和分化最為有利,，因此分別選擇2%和3% GelMA用于封裝這兩種細胞,。

圖4. 優(yōu)化GelMA濃度以提高HUVECs和CCD - 18Co細胞的打印性和活力,。  

5. CCD - 18Co和Caco - 2細胞在TTMI中的相互作用，將Caco - 2細胞和CCD - 18Co細胞分別接種或共接種在3% GelMA打印的PCL管狀網(wǎng)上,，運用熒光顯微鏡觀察細胞存活和生長情況，通過CCK - 8實驗檢測細胞增殖,，用堿性磷酸酶（ALP）和DNA檢測評估細胞分化,，借助掃描電子顯微鏡（SEM）觀察微絨毛。研究了兩種細胞在TTMI中的相互作用對細胞增殖和分化的影響,。結(jié)果表明,，兩種細胞共培養(yǎng)促進了Caco - 2細胞的增殖和分化，PCL管狀網(wǎng)有助于細胞間相互作用,。

圖5. CCD - 18Co和Caco - 2細胞的相互作用促進腸上皮生長,。  

6. TTMI的生物學(xué)特性，對含有三種細胞的TTMI進行細胞追蹤,、組織學(xué)染色,、免疫染色和跨內(nèi)皮電阻（TEER）測量等實驗，研究了TTMI中細胞的增殖,、分化,、定位以及上皮膜形成情況。結(jié)果表明,，TTMI中三種細胞類型的排列與天然腸道相似,，細胞增殖和分化良好，細胞間相互作用促進了上皮膜的形成,，證明TTMI可作為體外模型模擬腸道的部分功能,。

圖6. TTMI的生物學(xué)特性。

研究結(jié)論
本研究構(gòu)建了一種模仿人類胎兒腸道結(jié)構(gòu)和細胞組成的三培養(yǎng)管狀網(wǎng)狀腸道（TTMI）,，這是人工腸道發(fā)展的重要進展,。研究將人臍靜脈內(nèi)皮細胞（HUVECs）、人正常結(jié)腸成纖維細胞（CCD - 18Co）和人結(jié)直腸腺癌細胞（Caco - 2）整合到人工腸道中,，發(fā)現(xiàn)其可支持細胞增殖,、分化并形成功能性腸屏障，證實了三培養(yǎng)技術(shù)在組織工程中開發(fā)可植入材料的適用性,。通過結(jié)合多頭3D生物打印機與混合打印技術(shù),、旋轉(zhuǎn)接種板、四軸控制系統(tǒng)以及加熱和雙冷卻模塊,，成功制備出TTMI,。該模型細胞增殖和分化率高，細胞間相互作用促進了上皮細胞分化和上皮膜形成,。不過,，TTMI模型仍需體內(nèi)驗證,。此外，4D形狀記憶技術(shù)的發(fā)展可能有助于提升其植入后的機械強度和彈性恢復(fù)能力,。TTMI為研究腸道生理,、藥物吸收和疾病建模提供了有用平臺，在再生醫(yī)學(xué)和個性化移植治療方面具有潛在應(yīng)用價值,。

文章來源：
https://doi.org/10.1002/adfm.202424495