3D打印技術(shù)在進(jìn)化：3D梯度水凝膠提供人造細(xì)胞生態(tài)位

帶狀組織在軟骨結(jié)構(gòu)和功能上起著重要的作用，然而迄今為止開發(fā)的大多數(shù)組織工程策略只能允許具有均勻生化和機(jī)械特征的軟骨再生,。為了更好地還原組織結(jié)構(gòu)和功能，對(duì)于具有仿生梯度生態(tài)位特征的工程材料有巨大的需求,，這些材料可以重現(xiàn)原生組織,。為了解決這個(gè)關(guān)鍵的未滿足需求，據(jù)南極熊了解,，近日,，斯坦福工程師們成功地將軟骨樣細(xì)胞和間充質(zhì)干細(xì)胞裝入3D水凝膠。

據(jù)悉,，這是一種快速形成組織梯度水凝膠作為具有生化和物理特性可調(diào)的3D細(xì)胞生態(tài)位方式,。當(dāng)密閉在硬度梯度水凝膠中時(shí)，軟骨細(xì)胞和間充質(zhì)干細(xì)胞都顯示出帶狀特異性的反應(yīng)和細(xì)胞外沉積,，這可模擬了關(guān)節(jié)軟骨組織的區(qū)域構(gòu)成,。使用blebbistatin阻斷細(xì)胞機(jī)械感應(yīng)消除了具有硬度梯度的3D水凝膠中的軟骨細(xì)胞帶狀區(qū)反應(yīng)。這樣的組織大小的梯度水凝膠可以提供3D人造細(xì)胞生態(tài)位,，從而使各種組織類型能夠打印帶狀結(jié)構(gòu)或者組織接觸面,。

盡管帶狀結(jié)構(gòu)在軟骨結(jié)構(gòu)和功能中起重要作用，但迄今研發(fā)的大多數(shù)組織工程策略只允許具有均勻的生化和機(jī)械特征的軟骨再生,。軟骨損傷是極為常見的,，但是由于軟骨的弱細(xì)胞性和無(wú)血管的特性，軟骨具備有限的自愈能力,。由于關(guān)節(jié)軟骨從淺表層轉(zhuǎn)移到深層,，軟骨的細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）的硬度開始增加，ECM的成分如葡糖氨基葡聚糖的含量增加,，以及肥厚性軟骨標(biāo)志物如X型膠原蛋白含量增加,。
研發(fā)了各種策略進(jìn)行具有梯度信號(hào)的生物材料的制備,，并作為細(xì)胞的生態(tài)位，例如靜電紡絲,，模塊化水凝膠體系,，激光掃描光刻，對(duì)流擴(kuò)散,，微流體以及融合預(yù)制化微球,。然而，這些策略中的絕大部分通常需要冗長(zhǎng)的制造過(guò)程或者使用非細(xì)胞友好性的試劑,，這不能夠保證可通過(guò)均勻方式進(jìn)行細(xì)胞封存的組織標(biāo)尺的梯度生物材料的制造。因此,，在三維空間中,，梯度生態(tài)位置如何影響細(xì)胞介導(dǎo)的組織形成，在很大程度上尚未可知,。此外,，雖然最近的研究在針對(duì)力學(xué)信號(hào)（如基質(zhì)的硬度）在調(diào)節(jié)各種細(xì)胞命運(yùn)（包括細(xì)胞的增殖和分化）的作用上取得了突破，但是激活或者阻斷機(jī)械感應(yīng)如何影響3D組織中細(xì)胞命運(yùn)和ECM的形成仍有待研究,。

來(lái)源：Tissue Engineering

為了將帶狀結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)為工程軟骨,，一種策略是將軟骨細(xì)胞進(jìn)行模式分類，從有不同區(qū)域帶狀特異性表型的軟骨細(xì)胞,，到不同層化的軟骨細(xì)胞,。利用連續(xù)的光聚合，多層水凝膠可以從不同的區(qū)域中被分離出來(lái),，并被封裝在不同的層中,，以更好地模擬體內(nèi)帶狀結(jié)構(gòu)。另一種策略是利用單一的細(xì)胞來(lái)源,，利用多層的水凝膠,，利用不同的生化和機(jī)械性能，進(jìn)行基質(zhì)特征的模式歸類,。

在介導(dǎo)細(xì)胞命運(yùn)和組織形成方面,，生物化學(xué)和物理的特征都發(fā)揮了重要作用。間質(zhì)干細(xì)胞(MSCs)和一種被包裹在多層支架上的軟骨細(xì)胞表現(xiàn)出帶狀特異性的分化,，這些多層支架具有空間變化的基質(zhì)組分和機(jī)械特征,。雖然上述的策略已經(jīng)改善了用均勻的水凝膠獲得的工程軟骨的帶狀結(jié)構(gòu)，但獲得的組織顯示出了獨(dú)特的層,，而原生軟骨則以連續(xù)的梯度方式過(guò)渡,。此外，由于界面上的水凝膠硬度的不連續(xù)性,，層間界面往往是脆弱的,，容易受到機(jī)械應(yīng)力的影響下分離,。

與多層水凝膠相反，仿生梯度水凝膠在生物化學(xué)和/或機(jī)械特征上具有連續(xù)的變化,，從而在在體內(nèi)可更精確的模擬組織連接和帶狀結(jié)構(gòu)形成,。為了來(lái)更好地模擬骨和軟骨接觸面，進(jìn)行MSCs在3D空間中的帶狀特異性分化的誘導(dǎo),，容納可溶性因子梯度的水凝膠通過(guò)含有不同梯度的重組人骨形態(tài)發(fā)生蛋白2（rhBMP-2）和胰島素生長(zhǎng)因子（rhIGF-1）的微球體所制造出來(lái),。

另外，還制備了不同基質(zhì)硬度的水凝膠,，并使用發(fā)育信號(hào)誘導(dǎo)區(qū)域依賴性的MSC分化,。還使用具有生物化學(xué)特征的聚丙烯酰胺（PAAM）水凝膠來(lái)制備含有不溶性基質(zhì)梯度（例如,硬度）的水凝膠。此外,，還開發(fā)了一種基于微流體的方法,，制備雙梯度聚乙二醇(PEG)水凝膠，其包含了化學(xué)和物理梯度,，但這種微尺度平臺(tái)不適合用于臨床空間上制造組織大小的梯度水凝膠,。

雖然細(xì)胞在體內(nèi)的3D生態(tài)位存留，但以前的報(bào)告主要局限于2D研究,，這是因?yàn)樵诮M織規(guī)模的三維梯度水凝膠中以快速和細(xì)胞友好的方式封裝細(xì)胞是一項(xiàng)挑戰(zhàn),。因此，仍然迫切需求開發(fā)一種生物材料平臺(tái),，通過(guò)這個(gè)平臺(tái)可以對(duì)在3D中的組織梯度水凝膠中的細(xì)胞進(jìn)行研究,。目前研究的目的是開發(fā)一種細(xì)胞兼容性好的方法，用于制造組織大小的梯度水凝膠作為3D細(xì)胞特征,，從而指導(dǎo)帶狀結(jié)構(gòu)的軟骨再生,。

我們假設(shè)具有硬度梯度的水凝膠將會(huì)誘導(dǎo)封存細(xì)胞在3D空間中產(chǎn)生帶狀特異性反應(yīng)，并且通過(guò)梯度水凝膠中新沉積的組織來(lái)模擬本身關(guān)節(jié)軟骨的帶狀結(jié)構(gòu),。為了測(cè)試這個(gè)假設(shè),，將新生的牛軟骨細(xì)胞或者人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞密閉在3D梯度水凝膠中7或21天。使用機(jī)械測(cè)定,、定量基因表達(dá),、生化檢驗(yàn)和組織學(xué)來(lái)評(píng)價(jià)梯度水凝膠中新形成組織的情況。

來(lái)源：科學(xué)橋研究院