蘭州大學研究團隊在3D打印骨軟骨方面取得進展

來源：高分子科學前沿 and 蘭州大學

近年來，3D打印技術突飛猛進。相比于傳統(tǒng)技術，3D打印技術更加精準和高效。它與普通的平面打印原理基本一致，只不過普通打印機內的“打印材料”是墨水和紙張，而3D打印機中是金屬、塑料、細胞等實物，它將打印材料一層層疊加起來，最終把計算機上的藍圖變成立體的實物。

3D打印軟骨可以用在修復人體軟骨的缺損上，它不僅能修復病理性軟骨缺損，而且能修復創(chuàng)傷性軟骨缺損，所以3D打印軟骨于治愈與軟骨相關的重大疾病和維護人類健康而言具有重大意義。

雖然只是人體骨格連接處很小的一部分，但軟骨卻是人身體上不可或缺的重要組成部分，人的坐臥行走都需要它的參與。可是，因為軟骨沒有血管、神經及干細胞，所以不像人體其他組織具有自我修復的能力，想要修復只能依靠人為干預。

蘭州大學口腔醫(yī)學院范增杰教授及其團隊充分利用3D打印這一新興技術，聯(lián)合美國康涅狄格大學化學與生物分子工程系SunLuyi教授團隊，通過物理交聯(lián)、光交聯(lián)和化學交聯(lián)三種交聯(lián)方法首次設計并成功制備了一種三層梯度結構的軟骨支架，日前，該研究成果以“3D打印羥基磷灰石梯度的水凝膠支架有效修復大鼠的骨軟骨缺損”為題發(fā)表在 《先進功能材料》（AdvancedFunctionalMaterials）上。

國際獨創(chuàng)

軟骨修復必須有能夠促使它自身分化的細胞，但是軟骨細胞沒有分化功能，必須讓干細胞介入來使軟骨擁有自我修復的能力，所以軟骨修復一直是醫(yī)學領域的研究重點和難點。

基于此，范增杰團隊致力于設計出一種能夠高度還原軟骨組織的結構，這種結構能夠誘導干細胞定向分化為軟骨和骨細胞，從而在缺損的地方形成一個完整的軟骨組織。

在剛開始構建軟骨時，范增杰團隊并沒有想到引進3D立體技術，而是采用了傳統(tǒng)的浸泡法。相較于3D打印技術，浸泡法流程更加復雜，“因為軟骨組織本身很復雜”。

軟骨細分為三層，最外層為軟骨層，再往下一層是鈣化層，最里面一層是軟骨下骨層，這三層由外向內硬度依次遞增，形成一個由軟到硬逐漸過渡的梯度結構。同時，這三層的化學組成也存在差異，軟骨層不含任何礦物質、全部由膠原纖維構成；鈣化層含有30%左右的羥基磷灰石；軟骨下骨層大概含有70%的羥基磷灰石，由此它們又形成了化學成分上的梯度結構。

要想修復軟骨組織，就必須想辦法恢復這三層組織。

傳統(tǒng)的浸泡法需要分別泡三次水凝膠來模擬這三層。范增杰說：“浸泡法的前端需要先把水凝膠做出來，再放到模擬液里去泡。第一次泡低濃度的，第二次泡中濃度的，第三次泡高濃度的，這樣軟骨才能形成一個梯度。”通過浸泡法分別將每一層泡好后再把三層疊加，雖然也能達到3D打印技術的效果，但其制備流程繁雜，并且所用時間漫長、效率很低。另外，浸泡法還不能規(guī)避溶脹的弊端，“如果水凝膠材料泡水時間太長，它就會發(fā)生溶脹，一溶脹，它的尺寸穩(wěn)定性就不那么好了。”

到底怎么樣才能高效保質地模擬出軟骨組織呢？范增杰及其團隊將目光轉向了3D打印技術，“因為3D打印技術具有提供高效精準的軟骨組織修復方法的可能性。”

他們首先用電腦建模，把軟骨的形狀、大小都設計好，然后制備墨水，使用多頭3D打印機來打印。第一個噴頭不加羥基磷灰石，打印出軟骨的第一層，第二個噴頭打印鈣化層，第三個打印軟骨下骨層，一層一層疊起來，直到形成一個比較完善的軟骨結構。由3D打印技術打印出的軟骨組織有較低的溶脹率和較高的修復率，因此它能夠更好地修復人體軟骨缺損，“這在國際上完全是我們獨創(chuàng)的”。

撥云見日
研究中，范增杰團隊時刻關注著3D打印軟骨技術在國際上的發(fā)展狀況，他發(fā)現(xiàn)國際上在軟骨打印方面存在一定弊端：“國際上現(xiàn)在依然沒有辦法同時模擬出兩種梯度的軟骨結構來，要么只有軟骨的化學梯度結構，要么只有軟硬梯度結構，還沒有人能夠做出同時具有兩種梯度的軟骨結構。”如前文所述，這主要是因為軟骨的三層梯度所含有的化學成分不同而導致精準調控三層的化學比例難度很大，“國際上還沒有辦法在保證軟硬梯度的同時兼顧化學梯度，而軟骨的修復需要需要同時實現(xiàn)兩方面的梯度結構。”

“看到國際上3D打印有局限性，所以我們就想再往前走一步，研究出一種同時實現(xiàn)軟硬和化學這兩方面的梯度結構的理論設計。”

實踐過程可謂困難重重，“因為這方面是一個沒有前人做過的工作，所以就沒有可以參照的對象”。

團隊面對的第一重困難便是打印墨水的制備，也就是打印軟骨原材料的制備。墨水中有一種化學物質叫海藻酸鈉，這種物質在打印過程中和氯化鈣的鈣離子反應從而容易產生團聚，團聚后的物質堵住打印所用注射器的針頭，打印就無法正常進行下去，因此整個打印流程中最關鍵的一步就是打印墨水的制備。

為了解決這個令人頭疼的問題，團隊經過反復討論終于想到了解決方法，他們在打印過程中增加了噴涂裝置，這一裝置能夠延緩團聚的反應，“這是我們的創(chuàng)新做法，在原來基礎上新建了噴涂裝置，這是一個霧化裝置，因為霧化比較緩慢，這樣反應的時間就延長了，物質就不會很快團聚，也就不會堵住打印針頭。”

團隊面臨的第二重困難是軟骨如何成形的問題。剛開始打印軟骨的時候沒有想到用雙網(wǎng)絡結構，所以在往水凝膠中加羥基磷灰石的過程中，一旦其含量加到70%時，水凝膠系統(tǒng)就會發(fā)生坍塌，就像往果凍里注入其他物質會讓果凍破碎一樣，“所以如果沒有雙網(wǎng)絡結構，整個軟骨就無法成形。”

對于如何維持軟骨理想的形態(tài)問題，范增杰團隊的研究進程又一次陷入了瓶頸，原來單一的結構無法保持軟骨形態(tài)的穩(wěn)定性。為此，團隊咨詢了SunLuyi教授的意見，“孫教授提供了一些建設性、指導性的意見，他在材料性方面很專業(yè)，補充我們這方面的知識缺陷，雙方優(yōu)勢互補。”

經過雙方團隊的深入探討和共同努力，范增杰團隊在原來的基礎上引進了雙網(wǎng)絡結構。雙網(wǎng)絡有軟硬兩種結構，硬的結構起支架的作用，軟的結構用來分散力量，“因為軟的結構可以拉伸，遇到強力的時候，軟的結構能夠輕松將力分解掉，所以軟硬兼有的雙網(wǎng)絡能夠幫助軟骨成形，并且讓軟骨擁有顯著的力學性能。要做成軟骨的話，水凝膠必須有好的力學性能，所以如果沒有雙網(wǎng)絡結構，水凝膠會坍塌，很難保證最后打印出來的軟骨形狀”，范增杰說道。

研究人員的缺乏同樣是團隊面臨的一大問題。團隊主要由本科生和研究生組成，“學生需要首先保證課程學習，然后才能投身科研工作，如果有博士生，可能投入科研工作的時間精力就能更充足一些。但我們的學生都很努力，今年疫情期間學生基本也都沒回家，一直在實驗室加班加點趕項目進度。”

量身定“骨”

在范增杰團隊的研究中，他們實現(xiàn)了根據(jù)軟骨具體的缺損情況進行針對性建模打印，即根據(jù)病人軟骨的缺損情況進行個性化建模，打出來的軟骨完全符合缺損的形狀，“3D打印技術一大優(yōu)點就是個性化。每個病人軟骨缺損的深度、形狀和尺寸都不一樣，我們可以直接運用3D技術先掃描他的缺損部分，然后再把他缺損的部分呈現(xiàn)出來，這是傳統(tǒng)的浸泡法無法做到的。”浸泡法無法嚴格控制軟骨的形狀，這就會導致制備出的軟骨的尺寸和實際缺損尺寸有較大誤差。所以3D打印技術使整個軟骨制作的制備過程效率得到顯著提高：“以前浸泡法復雜的制備過程，現(xiàn)在3D打印一步就解決了。”

為了早日能夠將打印出的軟骨推廣應用到人身上，團隊首先在大鼠身上做實驗。實驗剛開始需要先在大鼠的骨頭上磨開一個洞，之后將它軟骨的三層結構都破壞掉，然后把打印好的軟骨給它放進去，再進行縫合。“我們做了很多實驗，測試過程中犧牲了好多老鼠，這個過程實際上來說是很長的，因為老鼠骨頭重新長好至少需要三個月的時間。”三個月以后，通過肉眼觀測和專業(yè)的MicroCT（微型CT）檢測，團隊發(fā)現(xiàn)大鼠的骨總量增加了，不僅長有軟骨，而且長有硬骨，這個結果為以后應用于人體提供了很高的可能性。

接下來，團隊致力于將3D打印軟骨技術推廣到人體應用上，范增杰說：“前期的動物實驗已經做完了，我們已經在推進臨床試驗，未來可能會跟蘭大一院、蘭大二院合作。”

但3D軟骨真正走向人體還需要漫長的過程，在這個過程中，需要經過國家的各項嚴格的實驗和檢測，這就要求3D技術要盡善盡美。

團隊希望，未來3D技術能夠達到硬骨和軟骨缺損同步修復的效果：“現(xiàn)在3D打印在硬骨缺損方面做的比較多，但是在硬骨和軟骨缺損一起修復的方面比較少。現(xiàn)在大部分軟骨缺損的人不是表面一層軟骨的創(chuàng)傷，而是軟骨和下面的硬骨整個一起創(chuàng)傷。現(xiàn)在來說3D打印基本上是打印軟骨的只打印軟骨，打印硬骨的只打印硬骨，都沒有把下邊的硬骨和上面的軟骨一起構建出來。現(xiàn)在我們團隊有前期的工作基礎了，未來希望能夠完整打印出來一塊既有軟骨又有硬骨的骨組織。如果能打印出來，它的意義就非常大了。”

部分原文Figures:

圖1.3D打印梯度支架修復大鼠骨軟骨缺損的流程圖。(A)電子噴霧裝置。(a-c)分別為“0% nHA”、“40% nHA”和“70% nHA”墨水。(i)-(iii):骨軟骨區(qū)的淺層(軟骨)、中層(鈣化軟骨)和深層(軟骨下骨)。( SA:海藻酸鈉; CA:海藻酸鈣; AM:丙烯酰胺; PAM:聚丙烯酰胺)。

該研究制備的三維支架由軟骨層（純水凝膠）、模擬鈣化軟骨的界面層（40/60%（w w-1）nHA/水凝膠）和模擬軟骨下骨層的70/30%（w w-1）nHA/水凝膠底層組成，具有三層梯度結構，能夠精確地與軟骨、鈣化軟骨和軟骨下骨的生物醫(yī)學功能相匹配。具體的制備過程見圖2。該過程可分為三個主要步驟：(1) 三種水凝膠墨水的制備；(2) 3D打印墨水；(3) 先后進行光交聯(lián)和Ca2+交聯(lián)。最重要的技術創(chuàng)新在于應用電子噴涂裝置來控制Ca2+的緩慢釋放以防止海藻酸鈣的快速形成，這使得70/30%（w w-1）nHA/水凝膠層的打印成為可能。

圖3.各種3D打印支架的照片。(A)從左至右分別為“0% nHA”、“40% nHA”、“70% nHA”(用羅丹明染成紅色)和“G-nHA”。(B)3D打印人工半月板的模型: “0% nHA”(a)、 “40% nHA”(b)、“70% nHA”(c)和“G-nHA凝膠(d);(e&f)分別為浸泡在CaCl2溶液前后的圖片。(C)進行拉伸測試的水凝膠支架:“0% nHA”(a)、“40% nHA”(b)、“70% nHA”(C)和“G-nHA”(d)的俯視圖，以及(e)“G-nHA”支架的側視圖。

圖4. 不同nHA/水凝膠質量比的支架材料的表征。A) FTIR光譜；B)XRD圖譜；C)SEM圖像；D)和E)不同支架的拉伸和壓縮強度。

圖5. 大鼠6周和12周后的骨軟骨再生的大體觀和微CT掃描圖像。(紅色矩形表示缺陷區(qū)域;白色箭頭表示未完全降解的支架和骨樣組織的混合物)

圖6. 大鼠骨軟骨再生的染色分析。(A-G)分別為對照組、BMSCs組、“G-nHA”組、“0% nHA+BMSCs”組、“40%nHA+BMSCs”組、“70%nHA+BMSCs”組、“G-NHA+BMSCs”組。(紅色箭頭:正常組織與再生組織的分界;黑色箭頭:降解支架留下的缺損區(qū)域)