誘導(dǎo)自然骨生成，用于3D打印的促成骨互穿網(wǎng)絡(luò)生物墨水

來源：EngineeringForLife

生物打印是一種新興的增材制造方法,，用于制備再生醫(yī)學(xué)的3D結(jié)構(gòu),。然而，開發(fā)具有高打印性,、結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性,、生物降解性和生物活性特性的細(xì)胞相容生物墨水仍然是將3D生物打印技術(shù)轉(zhuǎn)化為臨床前和臨床模型的主要挑戰(zhàn)。

來自Texas A&M University的Akhilesh K. Gaharwar團(tuán)隊開發(fā)了一種納米工程離子-共價糾纏(NICE)的互穿網(wǎng)絡(luò)生物墨水配方,，用于3D骨生物打印,。通過一系列實驗證實了NICE生物墨水在制造患者特異性、可植入的3D支架用于修復(fù)顱頜面骨缺損的能力,。該生物墨水有望推動3D打印再生醫(yī)學(xué)的發(fā)展,。相關(guān)論文“NanoengineeredOsteoinductive Bioink for 3D Bioprinting Bone Tissue”發(fā)表在ACS Applied Materials ＆ Interfaces雜志上。

NICE生物墨水有三個主要成分：共價交聯(lián)的甲基丙烯酰明膠(GelMA),，離子交聯(lián)的卡帕卡拉膠(kCA),，和靜電帶電的納米硅酸鹽(nSi)。GelMA提供了一種類似細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)的環(huán)境,。kCA是從海提取的多糖,，可以通藻中過鉀離子進(jìn)行離子交聯(lián)(圖1A)。GelMA和kCA的結(jié)合形成了離子共價糾纏網(wǎng)絡(luò)(圖1A),。這種結(jié)合極大地提高了水凝膠的機(jī)械強(qiáng)度和韌性,。

為了評估生物墨水的可打印性，研究者選擇了一個能夠打印的高長寬比結(jié)構(gòu),，從而找到一系列可打印的成分(圖1B-C),。結(jié)果表明，如果沒有足夠的kCA,GelMA和nSi打印效果不好,，因為它們在熱凝膠前會流動(圖1D),。kCA提供臨界粘度和屈服應(yīng)力，在擠壓層冷卻并通過熱凝膠固化時,，將其固定在適當(dāng)位置,。

圖1 NICE生物墨水設(shè)計和打印性能評估

接下來研究者設(shè)計了峰保持流變性試驗來模擬3D打印過程中的生物墨水環(huán)境,。交聯(lián)的3D打印水凝膠能夠維持剪切、彎曲和拉伸等機(jī)械變形,，沒有明顯的永久變形,，并能迅速恢復(fù)其原始形狀(圖2B)。將支架交聯(lián)并植入下頜骨的熱塑性模型中發(fā)現(xiàn),，NICE生物墨水能夠迅速將表面粘在一起,，抵抗剪切和分層力（圖2 D）。根據(jù)這些結(jié)果,，最終選擇7.5% GelMA,、2%nSi和1%kCA作為優(yōu)化的生物墨水進(jìn)行進(jìn)一步測試。

圖2 NICE生物墨水的流變性和3D打印結(jié)構(gòu)的力學(xué)性能

3D生物打印支架最初是透明的,，但培養(yǎng)60天后,，支架變得不透明(圖3A)。力學(xué)測試顯示,，3D打印支架在PBS和培養(yǎng)基的作用下,，其壓縮模量和韌性在14天內(nèi)保持不變，但在第21天出現(xiàn)顯著損失(圖3B),。支架在60天內(nèi)保持了結(jié)構(gòu)的完整性,，并保留了超過80%的初始質(zhì)量(圖3C)。掃描電鏡成像顯示,，從第14天開始微觀結(jié)構(gòu)密度增加(圖3D),。這表明，發(fā)生了大量的細(xì)胞介導(dǎo)的重塑,，其廣度足以將3D打印支架的宏觀結(jié)構(gòu)結(jié)合在一起,。

圖3 NICE支架支持細(xì)胞誘導(dǎo)的基質(zhì)重塑

然后研究者使用組織學(xué)方法評估了幾個月以來由hMSCs對NICE生物打印支架的重塑，顯示軟骨形成的軟骨內(nèi)骨化樣重塑過程,，隨后礦化,，類似于自然骨形成。結(jié)果表明,，NICE生物墨水即使在沒有成骨誘導(dǎo)因子的情況下也能誘導(dǎo)成骨分化和組織重塑,。此外，在這幾個月的培養(yǎng)和重塑過程中,，支架保持其整體形狀和完整性,，這表明支架的生物降解與細(xì)胞重塑是同步的。（圖 4）

圖4 3D生物打印支架的ECM重塑

研究者用Von Kossa和茜素紅染色來區(qū)分類骨質(zhì)和實際鈣化骨(圖5A),。正如預(yù)期的那樣,，VonKossa和茜素紅在早期的時間點上都沒有顯著的鈣或磷酸鹽存在，但幾周后，可以看到顯著的鈣和磷酸鹽沉積,。使用鈣-甲酚酞絡(luò)合酮測定法定量檢測鈣含量并且通過EDS顯示鈣含量的變化(圖5B-D),。結(jié)果顯示，支架內(nèi)最初并沒有鈣的存在,，培養(yǎng)60天后,，由于hMSCs成骨分化，鈣和磷酸鹽含量增加,。

圖5 3D生物打印支架的礦化基質(zhì)

為了證實軟骨內(nèi)成骨，研究者使用RNA全轉(zhuǎn)錄組測序來表征hMSCs中的基因表達(dá),。通過對暴露于nSi的hMSCs的全轉(zhuǎn)錄組測序,，可以確定軟骨內(nèi)骨形成的基因表達(dá)增加。值得注意的是,，BMP和TGF信號同時存在,，它們的SMAD信號通路表達(dá)增加，表明NICE能誘導(dǎo)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞軟骨內(nèi)分化,。（圖 6）

圖6 nSi對hMSC基因表達(dá)的影響

綜上所述,，這種NICE生物墨水具有3D生物打印骨組織的多種理想特性，包括高打印性能,、酶降解性和骨誘導(dǎo)性,。這項研究的最終目標(biāo)是為患者打印特定的骨支架來精確匹配他們的損傷。這種技術(shù)將作為一種可定制的,、易于操作的自體骨移植替代方案,，為外科醫(yī)生提供更多的骨手術(shù)選擇。

參考閱讀：

David Chimene, Logan Miller, Lauren M.Cross, Manish K. Jaiswal, Irtisha Singh, and Akhilesh K. Gaharwar.Nanoengineered Osteoinductive Bioink for 3D Bioprinting Bone Tissue. ACSApplied Materials & Interfaces.

https://doi.org/10.1021/acsami.9b19037