清華BRE團(tuán)隊AFM：載細(xì)胞微凝膠雙相生物墨水的3D生物打印

來源： 生物打印與再生工程

導(dǎo)讀：擠出式打印作為最常見的3D生物打印方法,，面臨的一個關(guān)鍵挑戰(zhàn)是難以兼顧可打印性能和功能性,，使得可供選擇的生物墨水種類受到了極大的限制,。近日,，清華大學(xué)機(jī)械工程系熊卓和張婷課題組(BRE團(tuán)隊)在Advanced Functional Materials (最新影響因子: 18.808)發(fā)表題為“3D Printing of Cell-laden Microgel-based Biphasic Bioink with Heterogeneous Microenvironment for Biomedical Applications”的文章,，開發(fā)了一種具有超彈性和異質(zhì)組織微環(huán)境的載細(xì)胞微凝膠雙相生物墨水(Microgel-based Biphasic Bioink, 簡稱MB生物墨水),，能夠?qū)⒁幌盗兴�凝膠材料打印成具有高形狀保真度的復(fù)雜結(jié)構(gòu),，具有良好的超彈性能和機(jī)械可調(diào)性，能夠?qū)崿F(xiàn)微尺度異質(zhì)組織微環(huán)境,，擴(kuò)展了現(xiàn)有生物墨水的應(yīng)用范圍,，為生物醫(yī)學(xué)應(yīng)用(如組織工程、軟體機(jī)器人)提供了新的解決方案,。

本文第一作者為清華大學(xué)機(jī)械系生物制造中心博士后方永聰,，通訊作者為清華大學(xué)機(jī)械系生物制造中心的熊卓副教授、張婷副研究員,。本研究得到了清華大學(xué)人才引進(jìn)啟動經(jīng)費(fèi)基金(53330200321),，國家重點(diǎn)研發(fā)計劃項目(2018YFA0703004）,，國家自然科學(xué)基金面上資助項目(31771108)，中國博士后科學(xué)基金站前資助項目(2021TQ0184)等項目支持,。

背景介紹

3D生物打印技術(shù)因其能夠?qū)⒓?xì)胞和材料(如生物墨水)精確地堆積到三維復(fù)雜結(jié)構(gòu)中而引起了人們的極大興趣,，該技術(shù)在體外生物系統(tǒng)工程中常用于構(gòu)建病理模型和組織再生。目前已發(fā)展了多種生物打印技術(shù),，其中,，最常見的方式是擠出式生物打印——通過數(shù)字化設(shè)計控制生物墨水的擠出與組裝，然后迅速成型以保持打印結(jié)構(gòu)的保真度,。用于擠出式生物打印的生物墨水需要同時滿足可打印性和功能性,，但這通常來說是矛盾的，即濃度較高,、粘度較高的生物墨水更有利于微絲擠出和結(jié)構(gòu)穩(wěn)定,，從而獲得較高的形狀保真度，而濃度較低,、密度較低的聚合物網(wǎng)絡(luò)更有利于細(xì)胞的擴(kuò)散,、遷移和增殖。

近年來為解決這些問題,，國內(nèi)外的研究者們提出了很多的方法,，諸如使用細(xì)胞團(tuán)來制造復(fù)雜的組織結(jié)構(gòu)、添加流變改性劑提高初始粘度較低的水凝膠生物墨水的可打印性,、添加細(xì)胞相容性明膠提高打印能力,、使用懸浮打印技術(shù)擴(kuò)大打印窗口等，但同時也面臨著機(jī)械性能較差,、生物相容性差,、生物墨水種類受限、殘留影響打印結(jié)構(gòu)等問題,。

因此,，BRE團(tuán)隊開發(fā)出一種載細(xì)胞微凝膠雙相生物墨水，能夠在不同聚合物濃度的水凝膠中進(jìn)行3D打印,。MB墨水由兩部分組成：(ⅰ) 由載細(xì)胞微凝膠充當(dāng)?shù)姆稚⑾啵?ⅱ) 由水凝膠前驅(qū)體充當(dāng)?shù)倪B續(xù)相,。MB墨水在打印過程中具有優(yōu)異的流變性能，打印的結(jié)構(gòu)在交聯(lián)后也具有極好的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性,。相較于純水凝膠、純微球生物墨水(jammed microgel, 簡稱JM),，MB生物墨水表現(xiàn)出超彈性和更好的循環(huán)拉-壓性能,。此外，通過在連續(xù)相內(nèi)加入不同類型的細(xì)胞,，在打印的微絲結(jié)構(gòu)內(nèi)能夠形成異質(zhì)細(xì)胞微環(huán)境,。MB生物墨水的提出,，為擴(kuò)展現(xiàn)有生物墨水的應(yīng)用范圍開辟了新的途徑，也為組織工程應(yīng)用及生物醫(yī)學(xué)應(yīng)用提供了新的思路,。

1. MB生物墨水的制備與3D打印

本研究開發(fā)的MB生物墨水由兩部分組成：(ⅰ) 載細(xì)胞微凝膠在緊密堆積下作為分散相,，形成了MB生物墨水的第一級網(wǎng)絡(luò); (ⅱ) 水凝膠前驅(qū)體作為連續(xù)相滲入微凝膠之間的空隙，在微凝膠之間形成第二級網(wǎng)絡(luò),。使用5%甲基丙烯�,；�明膠(GelMA)制備MB生物墨水進(jìn)行測試，其中微凝膠使用了帶有紅色熒光標(biāo)記的GelMA,，連續(xù)相使用了綠色熒光標(biāo)記的GelMA,，通過熒光顯微鏡觀察拍照，發(fā)現(xiàn)連續(xù)相能夠按預(yù)期填充在微凝膠之間的空隙中,，比較紅綠的面積得到微凝膠和連續(xù)相在墨水中所占的比例(圖1c 微凝膠平均直徑約175μm,，占比80%)。

MB墨水制備方法：(ⅰ) 將載細(xì)胞的水凝膠前驅(qū)體注入微流芯片件中,，被連續(xù)的油相剪切形成微凝膠,，并在之后的通道/步驟中交聯(lián)成形；(ⅱ) 通過一系列“注液-離心-去除多余液體”的方式,，將微凝膠之間的空隙替換為所需要的水凝膠前驅(qū)體,。為平衡微凝膠中的細(xì)胞活性和微凝膠的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性，使用5.0wt% GelMA載C2C12細(xì)胞進(jìn)行測試,，以80mW/cm2光照強(qiáng)度交聯(lián)35s,，微凝膠中的細(xì)胞活性約為91.5%±4.2%。在微凝膠中使用Brdu染色標(biāo)記增殖細(xì)胞,，細(xì)胞增殖率從≈30%(Day1)提高到69.8%±8.5%(Day11),。通過F-actin染色能夠觀察到C2C12細(xì)胞在微凝膠外表面遷移擴(kuò)散。通過微流控方式能夠使用多種材料,、大小和細(xì)胞密度來制備載細(xì)胞微凝膠,，為進(jìn)行驗證，本研究制備出了細(xì)胞密度高達(dá)5×107/mL的微凝膠,。

使用載C2C12的MB生物墨水進(jìn)行打印實(shí)驗,，其中微凝膠直徑203.5±14.8μm，打印的微絲直徑535±35.2μm,。通過改變離心過程的離心力可以調(diào)節(jié)微凝膠的壓實(shí)情況,，但對微凝膠中的細(xì)胞活性會造成影響，在270G和500G離心力下生成的MB生物墨水,，其細(xì)胞活性分別為80.3%±3.6%和73.3%±3.4%,。在打印和二次交聯(lián)后，受剪切力和光照影響，微凝膠中的細(xì)胞活性由91.5%±4.2%下降為62.8%±7.4%,。盡管打印后的C2C12初始活性相對較低,，但隨培養(yǎng)時間的延長，細(xì)胞的生長速度較快,，從D1到Day13,，微絲內(nèi)的細(xì)胞增殖率增長了十余倍，同時,，在Day7時細(xì)胞活性＞95%,。在Day10-14，C2C12遷移至微凝膠外表面,，進(jìn)一步滲入微凝膠之間的空隙,。

圖1 載細(xì)胞MB生物墨水的制備與3D打印

2. MB生物墨水的流變性能

使用5.0wt% GelMA制備MB墨水、純GelMA墨水,、JM墨水測試流變性能,。三種墨水在室溫下均表現(xiàn)出剪切稀化性質(zhì)。在溫度測試方面,，純GelMA墨水會隨溫度的升高出現(xiàn)凝膠-溶液的轉(zhuǎn)變,，JM墨水不受溫度影響，MB墨水在4-35℃范圍內(nèi)也始終保持凝膠狀態(tài),，因此,，相比于純GelMA墨水，MB墨水在一定程度上擺脫了溫度的限制,，拓寬了打印窗口,。

考慮MB墨水微凝膠含量(M.F.≈80%/85%/95%)對于流變性能的影響，三組墨水均表現(xiàn)剪切稀化性質(zhì),，但墨水的粘度和屈服應(yīng)變會隨M.F.的增加而增大,，表明在更密實(shí)的堆積情況下，需要更大的應(yīng)變來破壞微凝膠之間的連接,，同時墨水在4-37℃條件下均能表現(xiàn)自愈合性質(zhì),。

考慮MB生物墨水受連續(xù)相的各種交聯(lián)策略的影響，分別使用PBS,、海藻酸鈉和GelMA作為連續(xù)相,，均表現(xiàn)出剪切稀化性質(zhì)和應(yīng)變屈服性質(zhì)，因此MB墨水流變性能取決于微凝膠堆積的密實(shí)情況,，而與微凝膠的組成和連續(xù)相無關(guān),，但連續(xù)相會影響打印結(jié)構(gòu)的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性和力學(xué)性能。

使用低濃度GelMA(3.75wt%)和海藻酸鈉(0.5wt%)制備微凝膠,，其中3.75wt% GelMA微凝膠在PBS溶液中能夠保持長期的穩(wěn)定,，細(xì)胞活性為67.5%±9.1%，0.5wt%海藻酸鈉微凝膠內(nèi)的細(xì)胞活性為85.3%±6.4%，將兩種微凝膠與GelMA連續(xù)相混合制成的MB墨水也能表現(xiàn)出類似的剪切稀化性質(zhì)和應(yīng)變屈服性質(zhì),，可作為墨水用于擠出式生物打印。

圖2 MB生物墨水的流變性能表征和組分多樣性

3. MB生物墨水的可打印性

為驗證MB生物墨水的可打印性,，使用內(nèi)徑510μm的噴嘴(21G)進(jìn)行懸空擠壓,，微絲直徑接近噴嘴，擠出3厘米后才因重力而斷裂,。MB墨水由于阻力較小,，在打印過程中能夠?qū)崿F(xiàn)均勻擠出，而JM墨水在打印過程中出現(xiàn)堵塞和不連續(xù)的問題,。對打印參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化后,，打印了15.0×25.0mm2的多層網(wǎng)格，相鄰層之間連接較好,。在打印的雙環(huán)結(jié)構(gòu)中可以觀察到打印絲的顆粒形態(tài),。由于MB墨水流變特性不受溫度影響，噴嘴溫度在15℃-30℃的范圍內(nèi)進(jìn)行打印時,，都不會影響打印的保真度,，有利于在溫度不穩(wěn)定的極端環(huán)境條件下進(jìn)行多材料3D打印和生物打印。

使用MB生物墨水打印標(biāo)準(zhǔn)管狀結(jié)構(gòu)來定量評估形狀保真度,，交聯(lián)后測量打印結(jié)構(gòu)的內(nèi)徑(I.D.),、外徑(O.D.)和高度，它們略小于設(shè)定值(＜5%),。使用純GelMA生物墨水,、MB生物墨水和JM生物墨水打印了直徑為10mm的半球，將打印出來的半球投影在玻璃表面,，形成一個完整的球體,，通過Image J軟件測量其直徑和圓度。MB生物墨水打印的半球顯示出更平滑的層間過渡,，更接近設(shè)定值(如直徑和圓度),，表明MB生物墨水提供了更高的結(jié)構(gòu)保真度。

在復(fù)雜結(jié)構(gòu)方面,，打印了厚血管,、半月板、鼻子,、耳朵和支氣管等具有挑戰(zhàn)性(懸垂,、薄壁、分支等)的結(jié)構(gòu),。同時也使用懸浮打印的方式打印了大腦模型,，表面顯示出了典型的折疊和褶皺區(qū)域，與數(shù)字模型進(jìn)行對比，誤差在0.5mm的比例約為94.6%,。此外,，3D打印結(jié)構(gòu)在培養(yǎng)液中放置一周后，其幾何形狀和尺寸都保持不變,。

圖3 MB生物墨水的3D打印性能和結(jié)構(gòu)保真度評價

4. MB生物墨水的超彈性

使用5.0wt% GelMA制備的MB墨水,、JM墨水、純GelMA墨水打印直徑10mm,、高5mm的圓柱并比較力學(xué)性能,，MB墨水(2.7±0.3 kPa)和JM墨水(2.2±0.2 kPa)彈性模量明顯低于純GelMA墨水(15.4±1.0 kPa)，但卻比純GelMA墨水有更大的彈性,，這可能是由于微凝膠的位移所產(chǎn)生的,。對于MB墨水來說，微凝膠在壓縮的情況下被限制在連續(xù)相中,，因此與JM墨水相比,，其彈性模量相對較高。

對于純GelMA墨水,，在40%應(yīng)變的幾個壓縮循環(huán)后,，疲勞裂紋很快在打印的圓柱內(nèi)開始增長。同樣,，對于JM墨水,，在60%的應(yīng)變下，打印的圓柱在少于20次壓縮循環(huán)后迅速疲勞,，最大應(yīng)力減小50%,。然而，對于MB墨水,，打印的圓柱可以在60%的應(yīng)變下重復(fù)壓縮1000次,。MB墨水組的所有滯回曲線重疊非常好，表明其超彈性,，在數(shù)千次加載下幾乎未發(fā)生塑性變形,。

打印了一些條帶來檢測在單軸拉伸和循環(huán)拉伸下的力學(xué)性能，MB條帶在拉伸時的斷裂應(yīng)變(141.7%±5.2%)遠(yuǎn)高于純GelMA條帶(63.8%±3.1%),，MB條帶彈性模量(4.3±0.7 kPa)遠(yuǎn)低于純GelMA條帶(20.7±1.2 kPa),，與壓縮的結(jié)果一致。而JM條帶的機(jī)械性能較弱,，很容易在拉伸下斷裂,，表明添加連續(xù)相來將微凝膠整合在一起對MB墨水至關(guān)重要。MB條帶可以通過高達(dá)100%應(yīng)變的極端變形拉伸,，并在松弛后恢復(fù)到原來的形狀,。凍干結(jié)構(gòu)的掃描電子顯微鏡(SEM)圖像證實(shí)了MB墨水的特征粒度,，斷裂區(qū)域的大部分微凝膠看起來仍保持完整或完全脫離連續(xù)相。

在不犧牲打印性的情況下,，可以通過調(diào)整微凝膠和連續(xù)相的剛度而改變MB墨水的機(jī)械性能,。例如，通過調(diào)節(jié)光照強(qiáng)度和曝光時間調(diào)節(jié)GelMA微凝膠的硬度,，由較硬的微凝膠(彈性模量65.3±11.6 kpa)構(gòu)成的MB墨水打印的圓柱彈性模量為9.4±1.1 kpa,，由較軟的微凝膠(彈性模量為30.1±8.6 kpa)構(gòu)成的MB墨水打印的圓柱彈性模量為4.7±0.7 kpa，這主要是由于更硬的微凝膠在壓縮下變形較小所致,。以5.0wt% GelMA(2.7±0.3 kPa)作為連續(xù)相的MB墨水比分別以2.5wt%GelMA(2.2±0.1 kPa)和1.5wt%海藻酸鈉(1.7±0.2 kPa)作為連續(xù)相的MB墨水更硬、更堅韌,。同時,，較低濃度(2.5wt%)的GelMA和海藻酸鈉作為連續(xù)相形成的MB墨水也表現(xiàn)出超彈性，在60%應(yīng)變下壓縮1000次后,，疲勞裂紋沒有擴(kuò)展,。在微凝膠/連續(xù)相內(nèi)添加細(xì)胞后，MB墨水的壓縮模量得到增加,，可能是由于微凝膠和連續(xù)相中細(xì)胞的顆粒強(qiáng)化效應(yīng)所致,，但其循環(huán)性能似乎有所下降。

圖4 MB生物墨水打印結(jié)構(gòu)的力學(xué)特性

5. MB生物墨水的異質(zhì)微環(huán)境對肝功能的促進(jìn)作用

MB生物墨水可通過連續(xù)相,、微凝膠分別包裹不同的細(xì)胞,，從而在單個打印微絲內(nèi)創(chuàng)建一個異質(zhì)性的細(xì)胞微環(huán)境。將HepG2和HUVEC分別封裝在7.5wt% GelMA MB墨水的微凝膠和連續(xù)中,，同時HepG2和HUVECs以相同的細(xì)胞密度直接混合作為對照,。載HepG2的微凝膠細(xì)胞活性約為90%，且能正常表達(dá)白蛋白,，使用MB墨水打印的組織在長時間培養(yǎng)后保持了結(jié)構(gòu)完整性和較高的細(xì)胞活性,。

使用CellTrackerTM熒光探針對HepG2(紅色)和HUVECs(綠色)進(jìn)行標(biāo)記。在MB墨水中,，HUVECs主要分布在微凝膠空隙,。與純水凝膠墨水組相比，MB墨水組的HUVECs在第3天和第7天表現(xiàn)出更高的增殖率,，形態(tài)拉長,，可能是MB墨水中與內(nèi)皮細(xì)胞限制相關(guān)的富集效應(yīng)，導(dǎo)致肝臟和內(nèi)皮細(xì)胞局部細(xì)胞密度增加以及細(xì)胞相互作用增強(qiáng),。在第6天用HepG2白蛋白和HUVECs抗血管性血友病因子(vWF)免疫染色打印的結(jié)構(gòu),，觀察到MB墨水中，HUVECs擴(kuò)散較好,，通過內(nèi)皮細(xì)胞組裝形成隨機(jī)的管狀血管結(jié)構(gòu),，覆蓋在HepG2微凝膠表面,。與水凝膠墨水相比，MB墨水中毛細(xì)血管狀網(wǎng)絡(luò)形成更好(總長度,、單位面積分支數(shù),、平均長度)。

圖5 3D打印構(gòu)建具有可調(diào)異質(zhì)微環(huán)境的血管化肝組織模型

相比于水凝膠墨水,，MB墨水打印的肝組織表現(xiàn)出更高的增殖率,。MB墨水組織和水凝膠墨水組織的白蛋白和尿素水平初始均低于二維培養(yǎng)模型，但在Day7時,，MB墨水組＞水凝膠墨水組＞二維培養(yǎng)組,。在細(xì)胞色素P450同工酶中選取CYP3A4和CYP1A1評估酶活性，結(jié)果表明,，MB墨水組＞水凝膠墨水組＞二維培養(yǎng)組,。

與水凝膠墨水組相比，MB墨水組的成熟肝臟標(biāo)志物TTR,、ALB在Day10的表達(dá)水平明顯升高,，而胎兒肝臟標(biāo)志物AFP的表達(dá)水平無明顯差異。western blot分析顯示,，與水凝膠墨水組相比,，MB墨水組總體白蛋白和MRP2蛋白水平較高。此外,，MB墨水組第7天CD31表達(dá)顯著升高,。這些發(fā)現(xiàn)證明了MB墨水中肝細(xì)胞的基因和蛋白表達(dá)更為成熟。

圖6 肝功能檢測及肝特異性基因和蛋白表達(dá)水平

總結(jié)

本研究中,，BRE團(tuán)隊開發(fā)了一種由微凝膠和連續(xù)相所組成的載細(xì)胞雙相生物墨水,，能夠通過墨水的流變特性(如剪切稀化、應(yīng)變屈服,、自愈合)提供更寬的生物打印窗口和優(yōu)異的生物打印能力,。該生物墨水具有很好的超彈性能，同時能夠通過在微凝膠和連續(xù)相中添加不同類型細(xì)胞的方式,，來構(gòu)建具有異質(zhì)細(xì)胞微環(huán)境的組織模型,，為生物墨水的設(shè)計提供了更靈活的選擇。未來,，載細(xì)胞雙相生物墨水可以進(jìn)一步與當(dāng)前的打印策略相結(jié)合,，以更好地模擬天然組織和器官的結(jié)構(gòu)復(fù)雜性和異質(zhì)性，同時也拓展了3D生物打印在組織工程和軟體機(jī)器人等生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中的應(yīng)用,。

關(guān)于BRE(Bioprinting and Regenerative Engineering)課題組

●  清華大學(xué)機(jī)械工程系生物制造中心熊卓副教授：長聘副教授,，特別研究員，博士生導(dǎo)師,，現(xiàn)任北京機(jī)械工程學(xué)會副理事長,，北京市生物制造及快速成形重點(diǎn)實(shí)驗室副主任,。2001年清華大學(xué)機(jī)械工程系參加工作，2005 年晉升副教授,，2010 年晉升教授,。曾任第四軍醫(yī)大學(xué)客座教授、軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所客座研究員,、清華大學(xué)深圳研究生院兼職教授等職務(wù),。曾擔(dān)任中國機(jī)械工程學(xué)會理事、中國機(jī)械工程學(xué)會生物制造分會常務(wù)委員/總干事,、中國宇航學(xué)會航天醫(yī)學(xué)工程與空間生物學(xué)專業(yè)委員會委員等學(xué)術(shù)兼職,。是最早進(jìn)入到生物制造這一新興的交叉學(xué)科研究領(lǐng)域，將3D打印技術(shù)拓展到生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的研究者之一,，長期從事細(xì)胞3D打印,、生物制造和心肌組織工程等領(lǐng)域研究。發(fā)表的學(xué)術(shù)論文被 SCI 收錄 41 篇,、 Ei 收錄 52 篇，在 SCOPUS 中被引用2900余次,，H 因子 29,，獲得中國發(fā)明專利授權(quán)17 項。曾獲得 6 項國家自然科學(xué)基金資助,，擔(dān)任其中 3 項的負(fù)責(zé)人,。曾獲北京市科學(xué)技術(shù)獎一項。

●  清華大學(xué)機(jī)械工程系生物制造中心張婷副研究員：副研究員,，博士生導(dǎo)師�,，F(xiàn)任中國機(jī)械工程學(xué)會生物制造工程分會總干事，中國生物材料學(xué)會生物材料先進(jìn)制造分會秘書長,。主要從事各類生物 3D 打印技術(shù)裝備研發(fā),、心肌組織工程與血管化、體外微環(huán)境及生物 反應(yīng)器,、組織/細(xì)胞芯片等生物制造相關(guān)交叉領(lǐng)域的研究,，并作為訪問學(xué)者在哥倫比亞大學(xué) Gordana Vunjak-Novakovic 教授團(tuán)隊從事心肌組織工程領(lǐng)域的研究工作。先后主持或參與國家自然科學(xué)基金青年基金,、中韓國際交流基金,，國家自然科學(xué)基金重點(diǎn)項目，863 計劃課題,、“重大新藥創(chuàng)制”國家科技重大專項等科研項目十余項,，參與撰寫 3D 打印相關(guān)的書籍 1 本，在 Biofabrication, PLOS ONE, AdvanceHealthcare Materials 等期刊及國際會議上發(fā)表論文 30 余篇,，申請或授權(quán)發(fā)明專利十余項,。

參考閱讀：
Yongcong Fang, Yihan Guo, Mengke Ji, Binhan Li,Yujiang Guo, Jieming Zhu, Ting Zhang*, Zhuo Xiong*, 3D Printing of Cell-LadenMicrogel-Based Biphasic Bioink with Heterogeneous Microenvironment for BiomedicalApplications, Advanced Functional Materials, 2021, 2109810.
https://doi.org/10.1002/adfm.202109810