南京財經(jīng)王立峰,、蔣棟磊：DLP打印仿生小腸絨毛細胞傳感器用于食品過敏原檢測

來源： EngineeringForLife

在細胞傳感器中，主要依賴于二維的細胞固定化方案,，但是二維的細胞培養(yǎng)環(huán)境只是簡單的細胞堆積形成空間上的錯位,，與人體微環(huán)境有很大區(qū)別,，而且體外組織模型存在著代價高,，周期長,，重復(fù)率低等缺點。之前研究均單純以肥大細胞2D狀態(tài)或與凝膠混合后的3D狀態(tài)固定于傳感界面（電極）的表面,，細胞只是單純的聚集在一起沒有形成模擬組織的立體結(jié)構(gòu),，無法全面真實的模擬體內(nèi)過敏原反應(yīng)機理，且缺乏原生器官的建筑特征,，從而無法產(chǎn)生更高層次的功能特征,，而真實體內(nèi)過敏反應(yīng)發(fā)生時肥大細胞是游離附著于組織和器官表面發(fā)生脫顆粒效應(yīng)的。過敏原蛋白被攝食消化后首先進入腸道進行吸收，因此小腸是過敏反應(yīng)發(fā)生第一效應(yīng)器官,。但由于現(xiàn)有的技術(shù)仍然存在挑戰(zhàn),，生物打印無法真正的模擬組織或器官的天然生理功能，本研究嘗試用3D打印宏觀尺度上打印小腸微絨毛結(jié)構(gòu),，通過調(diào)控組織尺寸和結(jié)構(gòu)，在其負載肥大細胞,，模擬體內(nèi)真實過敏環(huán)境,，又進一步實現(xiàn)3D立體式檢測，嘗試實現(xiàn)單一成分細胞檢測到組織工程檢測的跨步,，使三維組織檢測成為可能,，實現(xiàn)更真實更全面的生物傳感模擬。

相關(guān)研究以題為：A biomimetic ‘‘intestinal microvillus” cell sensor based on 3D bioprinting for the detection of wheat allergen gliadin發(fā)表于Bioelectrochemistry雜志,，南京財經(jīng)大學(xué)的王立峰教授為通訊作者,，蔣棟磊副教授為第一作者。

目前,，在3D打印中常用的是擠出式的打印方法,，擠出式打印是較成熟的生物3D打印方式，普遍采用的是溫敏成型工藝,，通過噴頭擠出絲狀材料逐層打印為三維實體,，適用性廣，可對大多數(shù)打印墨水良好匹配,，形成范圍廣闊的材料應(yīng)用領(lǐng)域,，但是對一些微小器件擠出式打印無法形成精確打印且打印過程中往往會造成出料不可控，噴頭堵塞,，材料浪費,。投影式光固化生物3D打印利用光的波長和熱作用可使光敏生物墨水發(fā)生聚合反應(yīng)，對墨水進行有選擇地固化,，就可以在不接觸的情況下打印所需的三維實體原形,，與其他3D打印技術(shù)的工藝相比，光固化原位點打印技術(shù)的突出優(yōu)點就是精度高,，成型快,、原材料利用率高（接近100%），構(gòu)建相對形狀復(fù)雜,、特征精細的打印體,，因其高精度的打印特點，可實現(xiàn)最小打印精度為25微米(μm)的打印結(jié)構(gòu),，已在體外組織構(gòu)建,、組織修復(fù)、藥物篩選、人工假體等相關(guān)領(lǐng)域有所應(yīng)用,，所以本次生物打印選用EFL-BP-8600投影式光固化生物3D設(shè)備精確打印出團簇狀的小腸微絨毛結(jié)構(gòu),。

圖1 小腸絨毛模型的建模與實物

在打印墨水的選擇上，選用以甲基丙烯�,；�明膠（GelMA水凝膠,，EFL-GM-90）為主打印墨水，因其GelMA為雙鍵改性明膠,，其溶液可通過光固化成膠,，GelMA分子中含有RGD細胞黏附序列，其形成的三維網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)具有優(yōu)異的生物相容性,，可以制造載細胞的具有微-納米多孔的水凝膠支架,，但對于單純的 GelMA 不具有導(dǎo)電性，無法更好地模擬生物組織內(nèi)微弱的導(dǎo)電環(huán)境,，細胞之間無法進行電信號交流,。因此，需要導(dǎo)電以提高檢測靈敏度且并不影響細胞活性的新材料,。目前有幾種方法可以提高電導(dǎo)率,，例如添加導(dǎo)電材料，包括金屬納米粒子,、氧化石墨烯,、碳納米管、導(dǎo)電聚合物等,。在電化學(xué)傳感器制備中,，氧化石墨烯為主的碳納米材料是最常用的導(dǎo)電材料，但其因為分散性較差和較大的顆粒尺寸無法在微米級別的光固化打印中使用,，而聚苯胺(PANi)和聚吡咯(PPy)具有良好的應(yīng)用前景,，但它們的主要缺點是不溶于水。因此,，迫切需要能夠分散于水中并與細胞相容的導(dǎo)電材料,。碳納米管由于其良好的生物相容性和優(yōu)異的電化學(xué)特性而被許多研究者關(guān)注。然而,，對于多壁碳納米管而言,，缺乏穩(wěn)定性和均勻性，很容易造成沉積是必須考慮的問題,。因此,，如何制備一種導(dǎo)電且水溶性的打印墨水是目前亟需解決的問題。我們使用酰肼化改性的多壁碳納米管,，可以穩(wěn)定分散在水中,，與凝膠一起使用,。這些帶正電的納米管理論上可以與帶負電的細胞膜相互作用，通過改善細胞粘附來增強其功能,。但是單一材料的使用并不具備顯著的信號放大,。復(fù)合的納米材料在傳感器的制備中占有重要角色，普遍的是與金屬進行復(fù)合,，但金系和銀系為主要代表的納米材料的昂貴成本等不足之處限制了其應(yīng)用,，銅納米材料則恰恰相反，價格低廉且容易合成,，具有良好的抗菌性,，高的電催化能力等最近受到許多研究者關(guān)注，尤其以銅納米材料基元來筑造更高級的三維納米體系,。

圖2 銅納米花的電鏡

圖3 復(fù)合導(dǎo)電水凝膠

細胞固定在絨毛狀結(jié)構(gòu)上如圖4,，激光共聚焦結(jié)果表明,，在短時間內(nèi)細胞可以固定在結(jié)構(gòu)表面,，該小腸絨毛狀結(jié)構(gòu)可以為RBL-2H3細胞提供良好的三維物理條件。對電化學(xué)過程形成了屏障,，阻止氧化還原探針進入電極表面,，從而導(dǎo)致電子轉(zhuǎn)移電阻增加。

圖4 細胞在微絨毛組織上固定

隨后,，對構(gòu)建的細胞傳感器進行電化學(xué)表征以及細胞固定化條件的優(yōu)化,，當(dāng)小腸微絨毛結(jié)構(gòu)放置在工作電極上(曲線d)時，電化學(xué)過程形成了一個屏障,，阻止了氧化還原探針進入電極的表面,。在添加MWCNT-CDH/FCONp(曲線b)后，工作電流明顯增加,，說明復(fù)合納米材料具有良好的導(dǎo)電性和較高的催化活性；當(dāng)RBL細胞被固定時,，峰值電流明顯降低(曲線c),，這可能是由于細胞粘附和電阻增加，阻礙了電子轉(zhuǎn)移,。對于細胞固定化的條件,，實驗結(jié)果表明，3D生物打印細胞傳感器優(yōu)化后的細胞數(shù)量和固定化時間為1×106 cell/mL和10分鐘,。

圖5 電化學(xué)表征及優(yōu)化

電化學(xué)細胞傳感器在食品過敏原蛋白的檢測中具有較好的應(yīng)用前景,，電化學(xué)阻抗譜法(EIS)是測定不同濃度小麥醇溶蛋白的有效方法。如圖4A所示,，隨著麥醇溶蛋白濃度從0.1 ng/mL增加到0.8 ng/mL,，Nyquist圖上的半圓直徑增大,，在麥醇溶蛋白濃度為1.0 ng/mL時達到最大值，表明細胞逐漸被激活,。同時,，生物活性介質(zhì)被釋放，這阻止了電子在電池和電極之間的轉(zhuǎn)移,，因此阻抗值不斷上升,。隨著濃度的不斷增加，阻抗呈現(xiàn)下降趨勢,，這表明醇溶蛋白濃度的增加會逐漸導(dǎo)致一些細胞的凋亡或死亡,，使得大量的細胞從凝膠的表面脫落，恢復(fù)了凝膠和電極之間的電子轉(zhuǎn)移,。如圖4D所示,，與對照組（圖4C）相比，細胞出現(xiàn)了明顯的形態(tài)變化,，如變形,、收縮和分泌顆粒的釋放，醇溶蛋白顯著增加了RBL細胞的脫顆粒,，導(dǎo)致胞內(nèi)顆粒稀疏,，胞漿空泡化。通過擬合等效電路阻抗曲線,，得到線性回歸方程,。如圖4B所示，Ret和麥醇溶蛋白濃度呈正相關(guān),。線性檢測范圍為0.1 ~ 0.8 ng/mL,，檢出限為0.036 ng/mL。具有良好的穩(wěn)定性和重現(xiàn)性,。

圖6 電化學(xué)檢測小麥醇溶蛋白

綜上,，本研究建立了一種簡單新穎的食品過敏原電化學(xué)檢測方法，具有在食品安全檢測與評價中的潛在應(yīng)用價值,。

文章來源：
https://doi.org/10.1016/j.bioelechem.2021.107919