浙江大學(xué)賀永教授團(tuán)隊(duì)：原位生物3D打印,，實(shí)現(xiàn)不規(guī)則創(chuàng)傷的原位修復(fù)

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混凝土通過(guò)石子被水泥的浸潤(rùn)賦予其良好的可打印性及強(qiáng)度,，也是建筑3D打印常用材料,。受混凝土啟發(fā),，浙江大學(xué)機(jī)械工程學(xué)院賀永教授團(tuán)隊(duì)（EFL團(tuán)隊(duì)）,，提出了全新的“生物混凝土”墨水思路：將預(yù)功能化的載細(xì)胞微球作為“石子”,，高濃度GelMA水凝膠預(yù)聚液作為“水泥”,，并開(kāi)發(fā)了機(jī)器人原位生物3D打印系統(tǒng)，實(shí)現(xiàn)了對(duì)不規(guī)則創(chuàng)傷的原位修復(fù),。

▲相關(guān)研究“In situ 3D bioprinting with bioconcrete bioink”發(fā)表在Nature Communications期刊上
https://doi.org/10.1038/s41467-022-30997-y

手術(shù)機(jī)器人與生物打印相融合
原位生物3D打印系統(tǒng)融合了手術(shù)機(jī)器人及生物3D打印技術(shù),，根據(jù)患者組織缺損處的形態(tài)，直接在缺損處沉積治療用生物墨水,，實(shí)現(xiàn)組織再生及修復(fù),。原位生物3D打印有諸多優(yōu)勢(shì)，因?yàn)閼?yīng)用場(chǎng)景的變化,，與常規(guī)生物3D打印相比增加了很多苛刻要求：

打印端環(huán)境多變：原位打印場(chǎng)景中,，打印環(huán)境可能是戰(zhàn)場(chǎng)、救災(zāi)等環(huán)境多變場(chǎng)合,，要求墨水流變學(xué)性能穩(wěn)定,，當(dāng)打印環(huán)境從低溫到高溫的大溫度范圍變化時(shí)不影響打印性能；

• 修復(fù)處血水等影響：墨水要能在較高的體溫及充滿(mǎn)血水的浸潤(rùn)環(huán)境下保持結(jié)構(gòu)不坍塌,、打印的細(xì)胞能高效存活,，并快速功能化以盡快起損傷修復(fù)作用；
• 快速功能化：相比于常規(guī)生物3D打印中可以通過(guò)長(zhǎng)時(shí)間灌流進(jìn)行功能化相比,，原位打印需要打印出的組織能快速發(fā)揮急救功能,，如何讓打印組織快速功能化是亟需解決的問(wèn)題；
• 優(yōu)異的粘附性能：打印結(jié)構(gòu)需與缺損組織間形成一定的結(jié)合力,，防止其在體內(nèi)修復(fù)中脫離缺損,，造成二次損傷；
• 急性救治便攜性：墨水適合放入急救包中野外攜帶,，用于軍事,、消防等高危領(lǐng)域的緊急救助。
  

與常規(guī)生物墨水相比,，“生物混凝土”墨水具有如下特點(diǎn)：

• 墨水中的低強(qiáng)度細(xì)胞微球與高濃度水凝膠打印后在微觀上類(lèi)似一系列微球+彈簧,，局部低模量，整體高模量,，兼具細(xì)胞發(fā)育及打印結(jié)構(gòu)形狀維持能力,；
• 墨水不是直接使用細(xì)胞做原材料,，而是經(jīng)過(guò)了培養(yǎng)并具有微組織功能的細(xì)胞球，打印后能更快地在受損位置發(fā)揮作用,，加速組織修復(fù),；
• 墨水具有良好的溫度穩(wěn)定性，在4-37 ℃范圍內(nèi)均可原位打�,�,；
• 由于墨水主體為穩(wěn)定固化的水凝膠微球，其沉積于血水環(huán)境中也能維持3D形態(tài),；
• 得益于水凝膠預(yù)聚液對(duì)缺損組織表面的浸潤(rùn)及氫鍵作用,，打印結(jié)構(gòu)的粘附性好；
• 墨水可通過(guò)液氮凍存攜帶到野外,，有望用于戰(zhàn)場(chǎng),、救災(zāi)等惡劣環(huán)境下急性救治。
  

圖1 “生物混凝土”墨水的設(shè)計(jì)思路及使用方式

為了驗(yàn)證“生物混凝土”墨水在原位打印場(chǎng)景中的適應(yīng)性,，研究人員分別從墨水的流變魯棒性,、原位可打印性、復(fù)合力學(xué)特性,、打印體/組織結(jié)合力,、體內(nèi)修復(fù)能力進(jìn)行了表征，并設(shè)計(jì)了緊急救援包使該墨水體系更加便攜,。

流變魯棒性：與晶體具有固定的熔點(diǎn)（凝固點(diǎn)）不同,，明膠等溫敏型生物墨水基質(zhì)材料的溶膠/凝膠狀態(tài)受溫度影響極大，這就使其流變性能易受溫度的影響,。在流變學(xué)表征中,，“生物混凝土”墨水呈現(xiàn)Bingham流體特性，并且由于水凝膠微球在墨水體系中的主體地位,，使其對(duì)大范圍的溫度變化（4-37 ℃）具有高度的魯棒性,，可適應(yīng)原位打印場(chǎng)景復(fù)雜多變的環(huán)境情況。

圖2 “生物混凝土”墨水的流變魯棒性

原位可打印性：“生物混凝土”墨水可在擠出端處于低溫,、中溫、高溫環(huán)境中時(shí)形成均勻的擠出纖維,。同時(shí),，在沉積端可以發(fā)現(xiàn)，即便傳統(tǒng)墨水在合適的擠出打印溫度中被擠出,，但由于接收平臺(tái)的溫度過(guò)高且充滿(mǎn)“血水”,，其迅速過(guò)度溶膠化并轉(zhuǎn)變成一汪液體，喪失了3D結(jié)構(gòu),。而“生物混凝土”墨水由于其主體為穩(wěn)定光交聯(lián)的微球,，即便在溫度較高和充滿(mǎn)“血水”的接收環(huán)境中，其依然能夠維持良好的3D結(jié)構(gòu)。這證明“生物混凝土”墨水能夠在原位打印中自適應(yīng)患者損傷處的復(fù)雜環(huán)境,。

打印體/組織結(jié)合力：“生物混凝土”墨水中的“水泥”成分可浸潤(rùn)缺損組織的微小縫隙,，光交聯(lián)后可與缺損處組織形成更大的摩擦力，并在氫鍵作用下形成較強(qiáng)的組織結(jié)合力,，防止打印體脫離患處,。

圖3 原位可打印性及打印體/組織結(jié)合力

復(fù)合力學(xué)性能：力學(xué)測(cè)試與仿真分析結(jié)果表明，“生物混凝土”墨水中的低強(qiáng)度水凝膠微球與高濃度GelMA預(yù)聚液固化后形成的高強(qiáng)度網(wǎng)絡(luò)解決了生物相容性和力學(xué)性能間的矛盾,，證實(shí)了其在原位打印中的力學(xué)適應(yīng)性,。

圖4 固化的“生物混凝土”墨水復(fù)合力學(xué)性能測(cè)試及仿真分析

組織修復(fù)能力：由于“石子”相是預(yù)功能化的細(xì)胞微球，打印到創(chuàng)傷位置后有很好的活性,，并能快速功能化,，4周即可實(shí)現(xiàn)大鼠顱骨的有效修復(fù)。

圖5 載細(xì)胞“石子”的體外存活,、伸展,、功能化測(cè)試

圖6 對(duì)顱骨缺損的體內(nèi)修復(fù)能力

便攜性：為“生物混凝土”墨水設(shè)計(jì)了便攜方案，緊急救援包內(nèi)包括裝載“石子”組分及“水泥”組分的保溫杯及液氮,、移動(dòng)電源,、USB加熱墊、無(wú)菌注射器,、3D打印噴頭,、試劑勺、紙巾等,，結(jié)合小型機(jī)器人打印系統(tǒng)或手動(dòng)打印模式即可在野外快速進(jìn)行原位修復(fù)手術(shù),，使其在未來(lái)適用于多場(chǎng)景的現(xiàn)場(chǎng)緊急救援工作。

圖7 裝載“生物混凝土”墨水的緊急救援包

除此之外,，實(shí)際的臨床案例中患者的組織缺損可由多種原因引起,，因而由事故造成的缺損結(jié)構(gòu)形態(tài)及尺寸大相徑庭。為了驗(yàn)證“生物混凝土”墨水對(duì)于不同組織缺損結(jié)構(gòu)的原位打印及修復(fù)能力,，設(shè)置了四種具有不同形狀,、不同大小的顱骨缺損大鼠“患者”模型（近似“長(zhǎng)方形”、“正方形”,、“梯形”,、“三角形”為底面的拉伸體缺損模型），作為四名具有不同顱骨損傷形態(tài)并需要原位打印修復(fù)的“患者”,。

原位打印平臺(tái)選用機(jī)械臂系統(tǒng),，并將注射泵系統(tǒng)夾持于該機(jī)械臂上以實(shí)現(xiàn)墨水的恒流量供應(yīng)。原位打印噴頭選用錐形塑料噴頭,。根據(jù)大鼠“患者”不同的顱骨缺損3D結(jié)構(gòu),，在“患者”缺損處進(jìn)行原位打印,。待打印結(jié)束后，利用405 nm藍(lán)光手電筒對(duì)墨水進(jìn)行光固化,，最后將“患者”傷口縫合并對(duì)傷口消毒,。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明“生物混凝土”墨水在各“患者”的原位修復(fù)中具有高度可行性及修復(fù)能力。

圖8 利用“生物混凝土”墨水及機(jī)械臂對(duì)不同顱骨缺損形態(tài)的大鼠“患者”進(jìn)行原位修