3D打印三培養(yǎng)微纖維支架雙階段釋放二甲雙胍促骨血管神經(jīng)再生

來(lái)源：EFL生物3D打印與生物制造

臨界尺寸骨缺損的再生是臨床難題，僅促進(jìn)成骨不足，血管和神經(jīng)支配對(duì)建立骨再生微環(huán)境至關(guān)重要，但現(xiàn)有支架多無(wú)法實(shí)現(xiàn)三者協(xié)同再生，且缺乏持續(xù)可控的釋放模式。傳統(tǒng)3D生物打印技術(shù)在構(gòu)建三維組織修復(fù)支架方面存在局限性，且多數(shù)生長(zhǎng)因子在促進(jìn)骨再生的同時(shí)，難以兼顧神經(jīng)和血管的生長(zhǎng)調(diào)控。   

來(lái)自首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京口腔醫(yī)院的白玉興教授、張珂教授合作開(kāi)發(fā)了3D生物打印水凝膠微纖維（aMF）包埋人牙周膜干細(xì)胞（hPDLSCs）的三培養(yǎng)體系（含hPDLSCs、人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞hUVECs和周細(xì)胞PCs），并將其整合到磷酸鈣水泥（CPC）支架中，構(gòu)建了二甲雙胍雙階段釋放系統(tǒng)。該系統(tǒng)通過(guò)第一階段CPC釋放二甲雙胍招募內(nèi)源性細(xì)胞建立初步微環(huán)境，第二階段aMF降解后釋放細(xì)胞與藥物，促進(jìn)三培養(yǎng)細(xì)胞互作及血管神經(jīng)生成。實(shí)驗(yàn)證明，該支架顯著提升骨、血管、神經(jīng)再生量（分別為對(duì)照組2.5倍、3倍、3.5倍），其機(jī)制與TRIM26基因調(diào)控的信號(hào)通路相關(guān)。   

相關(guān)工作以“3D-printed microfibers encapsulating stem cells in scaffold with tri-culture and two-stage metformin release for bone/vasculature/nerve regeneration in rats”為題發(fā)表在《Bioactive Materials》上。

圖1.研究設(shè)計(jì)示意圖。(A) 3D 生物打印 aMF-CPC 支架已證明能夠修復(fù)臨界尺寸骨缺損。(B) 3D 生物打印 aMF-CPC 支架可促進(jìn)骨骼、血管化和神經(jīng)組織修復(fù)。(C) 基于 3D 生物打印人牙周膜干細(xì)胞（hPDLSCs）的三培養(yǎng)系統(tǒng)，該系統(tǒng)以 hPDLSCs 為基礎(chǔ)，包含人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（hUVECs）和周細(xì)胞（PCs）。(D) 包含三培養(yǎng)細(xì)胞的長(zhǎng)入血管橫截面圖示。(E) 三培養(yǎng)系統(tǒng)內(nèi)發(fā)生的復(fù)雜相互作用動(dòng)態(tài)。

1. 3D生物打印微纖維-磷酸鈣水泥支架的設(shè)計(jì)與表征，通過(guò)FRESH技術(shù)與紫外固化工藝，制備了包埋人牙周膜干細(xì)胞（hPDLSCs）、人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（hUVECs）和周細(xì)胞（PCs）的三培養(yǎng)體系支架，并整合二甲雙胍雙階段釋放系統(tǒng)。利用掃描電子顯微鏡（SEM）、傅里葉紅外光譜（FTIR）和原子力顯微鏡（AFM）分析支架結(jié)構(gòu)，結(jié)果顯示其降解后形成100–300 μm大孔，力學(xué)性能（彎曲強(qiáng)度、彈性模量）優(yōu)于松質(zhì)骨，且二甲雙胍在CPC（階段一）和微纖維（aMF，階段二）中實(shí)現(xiàn)持續(xù)釋放，12天內(nèi)累計(jì)釋放率達(dá)85%。      

圖2.3D生物打印aMF-CPC支架的結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)、降解特性及藥物釋放曲線。   

2. 三培養(yǎng)體系的體外細(xì)胞行為與成骨分化，通過(guò)免疫熒光染色（PECAM1、Desmin）和活/死細(xì)胞染色，觀察三培養(yǎng)細(xì)胞在微纖維中的分布與增殖。CCK-8實(shí)驗(yàn)顯示，細(xì)胞比例為hPDLSCs:hUVECs:PCs=4:12:1時(shí)增殖活性最佳，堿性磷酸酶（ALP）活性和茜素紅染色（ARS）礦化結(jié)節(jié)量在200 mg/mL二甲雙胍作用下顯著提升，成骨基因（ALP、Runx2）表達(dá)上調(diào)2–3倍，證實(shí)三細(xì)胞互作協(xié)同促進(jìn)成骨與血管生成。      

圖3.三培養(yǎng)體系的細(xì)胞形態(tài)、存活率及成骨分化能力驗(yàn)證。

3. 細(xì)胞比例優(yōu)化與體外成骨活性對(duì)比，通過(guò)設(shè)置不同hPDLSCs:hUVECs:PCs比例（如4:12:1、1:3:1），結(jié)合ALP染色和ARS礦化結(jié)節(jié)分析，篩選出最佳三培養(yǎng)比例為4:12:1，該比例下細(xì)胞成骨分化活性最高，礦化結(jié)節(jié)面積較單一培養(yǎng)組增加3.5倍，表明細(xì)胞間相互作用對(duì)再生效果至關(guān)重要。      

圖4. 不同細(xì)胞比例的三培養(yǎng)體系成骨分化活性對(duì)比及最佳比例篩選。

4. 體內(nèi)骨缺損修復(fù)與血管神經(jīng)再生評(píng)估，在大鼠顱骨5 mm缺損模型中植入支架，通過(guò)Micro-CT、HE染色、Masson染色及免疫組化（CD31、CGRP）分析。結(jié)果表明，術(shù)后12周時(shí)，三培養(yǎng)+雙階段二甲雙胍組的新生骨體積/組織體積（BV/TV）為陰性對(duì)照組的2.5倍，血管密度（CD31+）和神經(jīng)纖維密度（CGRP+）分別提升3倍和3.5倍，炎癥因子IL-1β、TNF-α表達(dá)降低60%以上，顯示支架顯著促進(jìn)骨、血管、神經(jīng)協(xié)同再生。      

圖 5. 不同 3D 生物打印 aMF-CPC 支架的體內(nèi)成骨分析。

圖 6. 體內(nèi) 3D 生物打印 aMF-CPC 支架血管化的組織學(xué)分析。

圖 7. 體內(nèi) 3D 生物打印 aMF-CPC 支架神經(jīng)支配的組織學(xué)分析。  

5. TRIM26基因調(diào)控機(jī)制與信號(hào)通路解析，運(yùn)用RNA測(cè)序和蛋白質(zhì)免疫印跡（Western blot），發(fā)現(xiàn)二甲雙胍顯著上調(diào)TRIM26基因表達(dá)（log2FC=1.8），激活cAMP-MAPK通路并促進(jìn)Runx2蛋白表達(dá)。抑制或敲低TRIM26后，成骨和血管生成相關(guān)指標(biāo)顯著下降，證實(shí)TRIM26是調(diào)控三組織再生的關(guān)鍵因子，其機(jī)制與神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子通路協(xié)同作用相關(guān)。      

圖8.三培養(yǎng)體系在二甲雙胍作用下的差異基因表達(dá)譜、TRIM26互作網(wǎng)絡(luò)及信號(hào)通路驗(yàn)證。   

研究結(jié)論
本研究開(kāi)發(fā)了基于人牙周膜干細(xì)胞的三培養(yǎng)體系，并構(gòu)建了3D生物打印微纖維-磷酸鈣水泥（aMF-CPC）支架，實(shí)現(xiàn)了二甲雙胍的雙階段釋放及骨、血管、神經(jīng)組織的協(xié)同再生。實(shí)驗(yàn)表明，該支架通過(guò)三培養(yǎng)細(xì)胞間的復(fù)雜相互作用（hPDLSCs、hUVECs、PCs），顯著提升了成骨、血管生成和神經(jīng)支配能力：與陰性對(duì)照組相比，術(shù)后12周新生骨量增加2.5倍，血管和神經(jīng) ingrowth 分別提升3倍和3.5倍。機(jī)制研究發(fā)現(xiàn)，E3泛素連接酶TRIM26通過(guò)調(diào)控cAMP-MAPK信號(hào)通路參與這一過(guò)程。此外，支架具備良好的生物相容性、力學(xué)穩(wěn)定性及可控降解特性，為顱骨等臨界尺寸骨缺損的修復(fù)提供了新策略，在口腔頜面及骨科再生領(lǐng)域具有潛在應(yīng)用價(jià)值。

文章來(lái)源：
https://doi.org/10.1016/j.bioactmat.2025.05.011