3D打印動(dòng)態(tài)多器官芯片,！為2型糖尿病研究打下基礎(chǔ)

來(lái)源：EngineeringForLife  

2型糖尿病（T2D）是一種高發(fā)病率的慢性復(fù)雜疾病,，對(duì)各種器官造成嚴(yán)重?fù)p害,。T2D有許多病因尚未被完全闡明。盡管已經(jīng)建立了各種模型來(lái)了解T2D,，但重建T2D的組織特異性微環(huán)境和并發(fā)癥仍然十分困難,。近日，來(lái)自韓國(guó)浦項(xiàng)科技大學(xué)的Dong-Woo Cho,、韓國(guó)天主教大學(xué)的Jae Yon Won教授團(tuán)隊(duì)進(jìn)行了3D細(xì)胞打印進(jìn)行2型糖尿病模擬的組織特異性多器官片上病理生理學(xué)重建的相關(guān)研究,。研究成果以“Pathophysiological Reconstruction of a Tissue-Specific Multiple-Organ On-A-Chip for Type 2 Diabetes Emulation using 3D Cell Printing”為題于2023年03月09日發(fā)表在《Adv. Funct. Mater.》上。

本文開發(fā)了一個(gè)動(dòng)態(tài)多器官芯片,，模擬高血糖環(huán)境下T2D和內(nèi)臟脂肪組織（vAT）,，使用3D細(xì)胞打印與脫細(xì)胞外基質(zhì)（dECM）。該芯片由與T2D密切相關(guān)的胰腺,、脂肪組織和肝臟獨(dú)立部分組成,，并增加了視網(wǎng)膜以確認(rèn)T2D并發(fā)癥情況。此外,，在高血糖環(huán)境下,，T2D的病理特征在帶有vAT衍生的dECM生物墨水芯片中清楚揭示。引起了視網(wǎng)膜區(qū)細(xì)胞功能障礙,。此外,，在芯片上治療T2D藥物顯示出臨床上相同的療效。該芯片適用于再現(xiàn)T2D關(guān)鍵特征,，是一個(gè)有前途的藥物測(cè)試和T2D并發(fā)癥研究平臺(tái),。

圖1 對(duì)sadECM和vadECM生物匯的評(píng)估

通過脫細(xì)胞方法，制備了sadECM和vadECM生物匯,。生物匯在4℃時(shí)保持流體狀態(tài),，在37℃孵化后表現(xiàn)出熱交聯(lián)行為。對(duì)sadECM和vadECM與原生組織進(jìn)行生化評(píng)估比較表明脫細(xì)胞過程幾乎沒有留下DNA,，但其他細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）成分,，如膠原蛋白和糖胺聚糖（GAG）都高度保存。因此，使用脫細(xì)胞工藝制備的生物匯充分去除細(xì)胞成分,，并且適合于保持ECM成分,。使用人類脂肪來(lái)源的干細(xì)胞（hASC）在2%的膠原蛋白、sadECM和vadECM生物墨水中進(jìn)行活/死檢測(cè)和細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒（CCK）檢測(cè),�,；�/死試驗(yàn)顯示，生物墨水都具有良好的生物相容性,。包裹的hASCs在14天內(nèi)保持高活力,。特別是，vadECM生物墨水顯示出最高的增殖率,。以上結(jié)果證實(shí),，使用3D生物打印技術(shù)開發(fā)的結(jié)構(gòu)可以在細(xì)胞存活的情況下進(jìn)行制造，而且預(yù)處理的生物墨水有足夠的物理特性來(lái)支持該結(jié)構(gòu),。

圖2 sadECM和vadECM生物匯對(duì)脂肪生成分化,、細(xì)胞因子分泌和巨噬細(xì)胞活性的影響

在糖尿病病理環(huán)境中，脂肪細(xì)胞產(chǎn)生的細(xì)胞因子會(huì)吸引激活巨噬細(xì)胞,。被激活的巨噬細(xì)胞產(chǎn)生促炎細(xì)胞因子,，增加脂肪組織（AT）慢性炎癥。炎癥狀態(tài)的擴(kuò)大直接影響葡萄糖代謝,，增加T2D發(fā)展的可能性,。在這方面，本文進(jìn)行了實(shí)驗(yàn)來(lái)分析各生物墨水的脂肪細(xì)胞分化能力和巨噬細(xì)胞誘導(dǎo)的趨化因子分泌能力,。將hASCs分化為脂肪細(xì)胞后,，進(jìn)行油紅O染色，檢查vadECM,、sadECM和膠原蛋白生物墨水涂層組脂質(zhì)數(shù)量,。與其他組相比，vadECM生物墨水組的脂肪細(xì)胞產(chǎn)生了更多的脂肪生成表型和更多的脂質(zhì),。此外,，在vadECM生物墨水組中，細(xì)胞是最大的,，因?yàn)樗鼈兒�有最多的脂質(zhì)。白細(xì)胞介素-6（IL-6）和腫瘤壞死因子-α（TNF-α）在有或沒有巨噬細(xì)胞的vadECM生物墨水組中檢測(cè)到最高水平,。因此,，證明vadECM在產(chǎn)生由細(xì)胞因子分泌誘導(dǎo)的炎癥狀態(tài)方面優(yōu)于sadECM。為了證實(shí)生物墨水和巨噬細(xì)胞之間的相關(guān)性,，本文進(jìn)行了細(xì)胞遷移試驗(yàn),。結(jié)果顯示在AT室中有vadECM的組中，巨噬細(xì)胞的遷移最為活躍。以上結(jié)果表明,，vadECM支持差異化成脂線和封裝細(xì)胞生存,。此外，它還增加細(xì)胞因子的產(chǎn)生,，促進(jìn)了免疫細(xì)胞遷移或增殖,，與sadECM相比較。使用vadECM可以提高T2D相關(guān)炎癥的進(jìn)展,。因此,，在T2D芯片上使用vadECM可以可靠地模擬T2D的病理環(huán)境。

圖3 三維細(xì)胞打印的組織特異性多器官片上模型和多器官相互作用的影響

將不同類型的器官整合到一個(gè)芯片中,，作為T2D體外疾病模型,。使用定制的3D細(xì)胞打印機(jī)制造T2D芯片，選擇合適的細(xì)胞和生物墨水,。使用定制的多頭打印機(jī)的好處是可以在短時(shí)間內(nèi)一步到位生產(chǎn)芯片,，大大改善了細(xì)胞的生存能力，有利于精確和可重復(fù)的組織特異性微環(huán)境生產(chǎn),。實(shí)際制造的T2D芯片的每個(gè)隔室包含每個(gè)器官衍生的dECM生物墨水,，每個(gè)器官衍生的細(xì)胞封裝在其中，人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（HUVECs）作為一個(gè)單層位于每個(gè)隔室的頂部,。同時(shí)在芯片上驗(yàn)證了各器官之間的相互聯(lián)系,，并確認(rèn)了芯片上根據(jù)器官順序的代謝狀況的變化。在雙器官芯片中,，蛋白也被檢測(cè)到,，但它們的表達(dá)明顯高于單器官芯片中的表達(dá)。綜合芯片在所有代謝物中顯示出最高的蛋白質(zhì)水平,。這些結(jié)果表明,，芯片上各器官之間的相互作用可以顯著提高代謝物水平。此外,，為了證實(shí)對(duì)每個(gè)器官進(jìn)行分隔的效果,，本文比較了空間不分隔芯片和空間分隔芯片的功能，結(jié)果顯示所有確定的標(biāo)記物在空間分離芯片中都比在空間不分離的芯片中明顯檢測(cè)得好,。內(nèi)皮細(xì)胞的單層排列對(duì)產(chǎn)生成熟的血管結(jié)構(gòu)至關(guān)重要,，這對(duì)表達(dá)器官的成熟表型和每個(gè)器官的正常功能都很重要。因此,，芯片中必須有分層的內(nèi)皮細(xì)胞,，以模擬功能正常的器官。

圖4 T2D芯片在T2D并發(fā)癥研究中的適用性

T2D相關(guān)器官有幾種并發(fā)癥,，特別是與眼睛有關(guān)的并發(fā)癥很容易在體外模擬,。本文通過連接一個(gè)正常的視網(wǎng)膜區(qū)間，將T2D的概念擴(kuò)展到T2D組合模型。為制作一個(gè)合適的T2D并發(fā)癥模型,。本文實(shí)驗(yàn)了裝有vadECM的模型是否比裝有sadECM或collagen的模型更接近于模擬T2D并發(fā)癥,。連接T2D的正常視網(wǎng)膜室在芯片上穩(wěn)定了5天，用注射泵在特定的葡萄糖濃度下操作了2天,。為了比較不同模型之間的功能,，從每個(gè)芯片上收集了裝有RPE細(xì)胞的透析細(xì)胞，確認(rèn)緊密連接的崩潰程度和RPE細(xì)胞內(nèi)在功能變化,。用相同的標(biāo)記物進(jìn)行qRT-PCR,，以交叉檢查免疫熒光染色結(jié)果。在用vadECM和高糖培養(yǎng)基處理的芯片中,，所有標(biāo)記物的表達(dá)都減少了,，顯示了強(qiáng)烈的T2D特征。本文測(cè)量了各組跨膜電阻（TEER）值,，定量緊密連接的破壞程度,，以確認(rèn)RPE的功能。在高糖環(huán)境下配備vadECM的組的TEER值最低,，表明該組的緊密連接是最崩潰的,。綜上所述，在高血糖環(huán)境下,，裝有vadECM芯片的炎癥細(xì)胞因子分泌量最高,，從而主動(dòng)促進(jìn)了RPE緊密連接的破壞，影響了RPE細(xì)胞的內(nèi)在功能,。在這個(gè)模型中觀察到的由T2D條件引起的視網(wǎng)膜功能障礙證實(shí)了T2D芯片在T2D并發(fā)癥研究中的資格,。

圖5 T2D芯片上治療T2D的商業(yè)藥物的反應(yīng)水平

接著研究人員檢查了治療T2D藥物是否在芯片上正常工作。Tol促進(jìn)胰腺分泌胰島素,。Met阻礙肝臟的葡萄糖生成途徑,，激活A(yù)MPK途徑，促進(jìn)葡萄糖流入細(xì)胞,。因此,，Tol和Met最終可以降低BGL。為了證實(shí)T2D芯片作為藥物測(cè)試平臺(tái)的潛力,，我們制作了三種類型的模型,。結(jié)果顯示在T2D模型中出現(xiàn)了葡萄糖不耐受和胰島素抵抗，但在正常模型中沒有,。在T2D+Tol+Met模型中,，從用Tol+Met治療開始，葡萄糖濃度下降,，胰島素濃度迅速上升。相反，在沒有藥物治療的T2D模型中沒有發(fā)生,。表明T2D治療劑恢復(fù)了細(xì)胞的功能,，包括葡萄糖的吸收。隨后,，隨著各器官細(xì)胞對(duì)葡萄糖吸收的進(jìn)展,，葡萄糖濃度下降到正常范圍，導(dǎo)致胰島素分泌自然逐漸減少,。在沒有藥物治療的T2D模型中,，過度持續(xù)的胰島素分泌降在T2D模型中，持續(xù)的高血糖導(dǎo)致細(xì)胞膜崩潰,，影響了INSR在細(xì)胞膜上的預(yù)發(fā)送,。因此，與正常模型相比,，INSR表達(dá)減少了,。此外，由于炎癥細(xì)胞因子的增加,，INSR磷酸化被抑制,。

在T2D+Tol+Met模型中，細(xì)胞功能,，包括細(xì)胞膜重建,，得到了恢復(fù)。因此,，與T2D模型相比,，INSR的表達(dá)有所增加。此外,，INSR的磷酸化得到恢復(fù),，從而重新啟動(dòng)葡萄糖代謝，降低了BGL,。用Met處理時(shí),，TNF-α和IL-6水平下降。每組不同的ELISA結(jié)果表明,，Tol和Met達(dá)到了相同的T2D治療功效,，但有不同的作用機(jī)制。在用Tol治療的T2D患者中,，分泌了更多的胰島素,。在用Met治療的T2D患者中，炎癥細(xì)胞因子的分泌減少,。這些結(jié)果通過臨床試驗(yàn)得到了證實(shí),。芯片上的藥物治療模式與在試驗(yàn)中觀察到的病人一致,。因此，該芯片可以作為T2D治療藥物的精確測(cè)試平臺(tái),。

總之,，本文開發(fā)了一個(gè)模擬T2D的3D細(xì)胞打印多器官芯片。胰腺,、AT和肝臟用組織特異性的dECM生物匯打印,，并與一個(gè)灌注系統(tǒng)相互連接。開發(fā)的vadECM明顯增加了巨噬細(xì)胞和脂肪細(xì)胞中炎癥因子的產(chǎn)生,。用來(lái)模擬T2D的病理環(huán)境,。炎癥因子的釋放趨勢(shì)與一些臨床研究報(bào)告的T2D患者一致。芯片的制作采用最適合T2D模擬的器官分區(qū)和器官排列順序,。所有隔間的血管都能改善器官功能,。在芯片運(yùn)行過程中，葡萄糖不耐受和胰島素抵抗的發(fā)生以及炎癥細(xì)胞因子的釋放導(dǎo)致葡萄糖代謝受損,，導(dǎo)致整個(gè)胰島素信號(hào)傳導(dǎo)途徑出現(xiàn)問題,。此外本文還分析了該芯片在研究T2D并發(fā)癥和藥物測(cè)試方面的有效性。與T2D芯片相連的RPE細(xì)胞在模擬器官并發(fā)癥的功能上出現(xiàn)了嚴(yán)重的問題,。每種T2D治療藥物的機(jī)制在T2D芯片中可精確操作,。該芯片對(duì)各種T2D并發(fā)癥的研究具有很大價(jià)值，可作為T2D藥物開發(fā)的精確測(cè)試平臺(tái),。

文章來(lái)源：
https://doi.org/10.1002/adfm.202213649