大阪大學的Shinji Sakai團隊：可見光交聯(lián)甜菜果膠助力3D生物打印

來源： EngineeringForLife

甜菜果膠（SBP）通常由甜菜糖生產的廢棄副產品制成,，主要由甲基酯化的 α-(1,4)連接的半乳糖醛酸組成,。SBP還含有酚類,，SBP可以很容易地用于可見光介導的酚類交聯(lián)在三維生物打印系統(tǒng)而沒有化學修飾,。然而,，目前還沒有關于SBP通過光交聯(lián)進行水凝膠化的報道,，也沒有研究SBP作為生物油墨材料在3D生物打印中的應用,。

近日，來自大阪大學的Shinji Sakai團隊使用可見光介導的光交聯(lián)系統(tǒng)來獲得SBP水凝膠（圖1a-b）,，使用含有細胞的SBP水凝膠研究了SBP和光交聯(lián)系統(tǒng)對細胞活力的影響,。此外，使用基于擠壓的打印系統(tǒng)（圖1c）證明了由人肝母細胞瘤(HepG2)細胞,，SBP,，三（聯(lián)吡啶）氯化釕（II）六水合物（[Ru（bpy）3]2+）和過硫酸鈉（SPS）組成的生物墨水的3D生物打印。這種相關論文“Visible light photocrosslinking of sugar beet pectin for 3D bioprinting applications”于2023年5月15日在線發(fā)表于雜志《Carbohydrate Polymers》上,。

圖1 用于3D生物打印應用的甜菜果膠的可見光光交聯(lián)

1. SBP的表征和SBP溶液的粘彈性
首先,，研究者通過核磁共振和紫外-可見光譜確認了阿魏酸的存在（圖2a-b）。粘彈性對于制造具有良好形狀保真度的3D結構至關重要,，1.0,、3.0和6.0 wt% SBP的粘度剪切速率曲線如圖3所示，增加SBP濃度會增加SBP溶液的粘度,。SBP溶液在較高剪切速率下的粘度降低可歸因于聚合物鏈的排列,。

圖2 SBP的基礎表征

圖3 SBP 溶液的粘度-剪切速率曲線

2. SBP水凝膠的形成
接下來，通過光交聯(lián)值得了SBP水凝膠,。為了確認交聯(lián)機理,，使用熒光光譜法分析了SBP水凝膠中的二苯酚形成。如圖4a所示,，在SBP水凝膠中觀察到約420 nm處的熒光峰,，對應于二苯酚的形成。這一結果表明，可見光介導的SBP水凝膠反應確實是由SBP中苯酚基團之間的交聯(lián)引起的,。

為了進一步評估水凝膠過程,，在可見光照射下進行了流變測量。存儲模量（G'）僅在將可見光施加到溶液上時才增加（圖4b）,。該結果表明,，通過調整可見光的照射，交聯(lián)的簡便性和精確控制,。

圖4 SBP水凝膠的交聯(lián)機理探究

凝膠時間隨可見光強度的提高而減少,，高于153 W/m2時凝膠時間無明顯差異（圖5a）。后續(xù)均采用153 W/m2的可將光進行實驗,，通過增加SBP（圖5b）和SPS（圖5c）的濃度觀察到更短的凝膠時間,。同時，增加[Ru（bpy）3]2+濃度從0.5到4.0 mM顯示凝膠時間沒有顯著變化（圖5d）,�,？傮w而言，SBP水凝膠在60 s內形成,，在SBP濃度為6.7 wt%時觀察到的最短凝膠時間為6.0 s,，使用SPS和[Ru（bpy）3]2+濃度為1.0 mM。

圖5 可見光強度和藥品濃度對水凝膠成型的影響

3. SBP水凝膠的力學性能

機械性能分析顯示,，隨著照射時間從10分鐘增加到20分鐘,，楊氏模量更高（圖6a），照射30分鐘無進一步增加,。基于該結果,，研究者使用30分鐘的照射時間來評估水凝膠的楊氏模量,。通過將SBP的濃度從0.005增加到1.0 wt%（圖6b）和SPS從0.6增加到0.3 mM（圖1c），觀察到楊氏模量（p < 0.6）顯著增加,。與此同時,，[Ru（bpy）3]2+濃度對水凝膠的楊氏模量沒有顯著影響（圖6d）。結果表明,，SBP和SPS濃度是水凝膠化的關鍵因素,。

圖6 SBP水凝膠的力學性能

4. 擠出印刷系統(tǒng)中的印刷適性評估
然后，研究了SBP生物油墨在擠出印刷體系中的適印性,。將流速從1.2增加到2.0 μL/s可產生更寬的線（圖7a,，d）。較低的流速會導致擠出緩慢,，而較高的流速會導致油墨擠出過多,，從而導致印刷適性降低。隨后，研究了不同SPS和SBP濃度的油墨的印刷適性,。0.3–0.5 mM的SPS濃度導致寬線寬和低保真度結構,，而在767.1 mM的SPS濃度下觀察到較小的線寬和良好的保真度構建（圖7b，e）,。與使用4.0 mM SPS制造的相比,，進一步將SPS濃度增加到0.05 mM的線寬沒有顯著差異，并且構建體的保真度沒有明顯變化（圖7b,，e）,。因此，1.0 mM的SPS濃度足以用于擠出印刷,。

通過將油墨中的SBP濃度從1.0%增加到6.0wt%獲得了更小的線寬（圖7c,，f）。使用含有1.5 wt%（圖8 c）和3.0 wt%（圖8 d）的SBP濃度的生物墨水獲得了基于藍圖制造的具有6 mm高度的良好保真晶格結構（圖8a）,。而含有1.0wt%SBP的墨水沒有按照藍圖形成結構,，因此，SBP濃度為3.0和6.0 wt%用于制造各種結構（圖8）,。

圖7 流速,、SPS濃度和SBP濃度對3D結構線寬的影響

圖8 使用擠出印刷系統(tǒng)制造的各種SBP結構

5. SBP水凝膠對細胞活力的影響

接下來，研究者評估了包封在SBP水凝膠中對HepG2細胞活力的影響,。如圖9所示,，無論濃度如何，HepG2細胞在SBP水凝膠中都顯示出低PI染色細胞的存在,，從培養(yǎng)的第1天到第7天保持,。這一結果表明SBP與HepG2細胞的細胞相容性。

圖9 SBP水凝膠對細胞活力的影響

6. 3D生物打印
文章最后,，研究了該系統(tǒng)用于3D生物打印的可行性（圖10）,。從打印后第0天到第14天，PI染色細胞的存在變化最�,。▓D10b）,。此外，還觀察到SBP構建體中HepG2細胞的線粒體活性增加（圖10c）,。與2.3 wt% SBP中HepG2細胞相比,，6.0 wt% SBP細胞的線粒體活性更高，在第3天和第0天在7.14 wt% SBP構建體中觀察到細胞聚集體（圖10b）,，可能表明水凝膠中的細胞生長,。

圖10 3D生物打印

綜上，本文報道了通過光交聯(lián)制備SBP水凝膠及其在3D生物打印中的應用,。該水凝膠可以應用于3D生物打印,，并且打印在水凝膠中的HepG2細胞保持了14天的活力,。此外，HepG2細胞顯示出線粒體活性的增加,，這與聚集體的形成相結合,，表明細胞在水凝膠中的生長�,？偟膩碚f,，SBP和可見光交聯(lián)體系在生物醫(yī)學和組織工程應用中很有前途。

文章來源：https://doi.org/10.1016/j.carbpol.2023.121026