AFM|上海工程技術(shù)\武漢理工,、武漢大學(xué)聯(lián)合發(fā)高活性肽-金屬離子-骨水泥三重整合3D打...

高血糖及其誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激微環(huán)境對(duì)糖尿病骨缺損的修復(fù)提出了巨大的挑戰(zhàn),。上海工程技術(shù)大學(xué)朱同賀教授團(tuán)隊(duì)、武漢理工大學(xué)戴紅蓮教授團(tuán)隊(duì)和武漢大學(xué)中南醫(yī)院李景峰教授團(tuán)隊(duì)聯(lián)合開發(fā)了一種用于糖尿病骨缺損修復(fù)的新型TZGP (α-TCP/ZnO/GM@P2) 復(fù)合支架,。該文章名為: "A Triple-Integrated 3D-Printed Composite Scaffold of High-Activity Peptide-Metal Ion-Bone Cement Facilitates Osteo-Vascular Regenerative Repair of Diabetic Bone Defects" 發(fā)表在ADVANCED FUNCTIONAL MATERIALS上,。表征結(jié)果表明,，α-TCP水泥支架、ZnO納米顆粒和負(fù)載和保護(hù)P2 (一種新型甲狀旁腺激素相關(guān)肽) 的明膠微球?qū)崿F(xiàn)了互補(bǔ)的優(yōu)勢(shì),。TZGP支架在滿足松質(zhì)骨的機(jī)械強(qiáng)度要求的同時(shí),，彌補(bǔ)了無(wú)機(jī)支架中生物活性肽的不足。它的生物相容性得到增強(qiáng),，并且支架具有抗菌和抗氧化特性,。體外和體內(nèi)結(jié)果表明，TZGP支架釋放活性因子P2和Zn2+,，在高葡萄糖微環(huán)境中促進(jìn)細(xì)胞增殖和募集,，減少細(xì)胞活性氧積累，改善DNA損傷和線粒體穩(wěn)態(tài),，并誘導(dǎo)成骨血管生成分化,。與傳統(tǒng)的α-TCP 支架相比，TZGP支架表現(xiàn)出更優(yōu)異的生物降解性,，加速局部組織充盈,，促進(jìn)糖尿病骨缺損的骨堆積和血管重建。因此,，TZGP支架的新穎設(shè)計(jì)策略為修復(fù)糖尿病骨缺損提供了一種很有前途的方法,。

一、背景介紹
糖尿病(DM)是常見疾病,，全球超十分之一成年人患病,，作為全身性代謝內(nèi)分泌紊亂疾病，其以高血糖為特征,，引發(fā)骨代謝調(diào)節(jié)劑表達(dá)失調(diào)等病理微環(huán)境變化,，破壞骨代謝穩(wěn)定，增加骨質(zhì)疏松和骨折發(fā)生率,，還導(dǎo)致線粒體功能障礙,，給糖尿病患者骨缺損和骨折修復(fù)帶來(lái)挑戰(zhàn)。
在骨組織工程中,，磷酸鈣是常用的骨缺損修復(fù)材料,，如α-磷酸三鈣(α- TCP)骨水泥和β -磷酸三鈣(β-TCP)煅燒支架，生物相容性良好,。但單個(gè)TCP相生物降解性有限,、機(jī)械性能不佳、骨誘導(dǎo)性不足,、缺乏促血管構(gòu)建因子,，難以促進(jìn)糖尿病患者骨缺損愈合。β-TCP支架靠煅燒燒結(jié)制備，藥物負(fù)載為仿生涂層,，限制藥物釋放量和持續(xù)時(shí)間。α-TCP生物降解和吸收更快,，室溫下與弱酸性液體接觸會(huì)反應(yīng)形成鈣磷石并提供機(jī)械強(qiáng)度,，還能添加溫敏藥物，但降解早期釋放的弱酸性物質(zhì)不利骨修復(fù),，本研究添加氧化鋅納米粒子(ZnONPs)調(diào)節(jié) pH 值,，其降解產(chǎn)生的 Zn²⁺還能促進(jìn)成骨。

甲狀旁腺激素(PTH)參與骨轉(zhuǎn)化和鈣磷代謝,，有促進(jìn)骨形成,、血管化及骨吸收等作用。臨床主要靠間斷皮下注射全身給藥,，卻存在劑量大,、半衰期短、局部藥物濃度難維持,、局部應(yīng)用受限等問(wèn)題,。前期研究發(fā)現(xiàn)，PTH相關(guān)肽-2(P2)可低成本大量合成,。與PTH (1-34)相比,，P2鈣磷組織錨定能力更優(yōu)，局部藥物滯留時(shí)間長(zhǎng),，還能避免藥物突發(fā)釋放導(dǎo)致的高骨吸收,。表面功能化的P2支架材料，成骨和血管生成誘導(dǎo)能力比PTH (1-34)更好,，破骨細(xì)胞分化作用較弱,，利于骨量累積。不過(guò),，直接把P2混入骨水泥易破壞其結(jié)構(gòu)和活性,，難以有效載藥，而以明膠微凝膠(GMs)作為P2遞送載體,，能起到保護(hù)和控制P2釋放的作用,。

本研究擬采用α-TCP-ZnONP-P2復(fù)合的新策略，巧妙地將有機(jī)活性肽,、無(wú)機(jī)支架和金屬離子整合在一起,，制備出一種新型的3D多功能復(fù)合支架(TZGP支架)。從材料組分的角度看,，TZGP支架各組分將優(yōu)勢(shì)互補(bǔ),，顯著地改善了單純TCP支架降解速度慢、缺乏生物活性肽、存在酸性降解產(chǎn)物等不利因素,。從材料功能的角度看,，改善了單純TCP支架降解慢、缺生物活性肽,、有酸性降解產(chǎn)物等不足,。在功能上，TZGP支架滿足松質(zhì)骨機(jī)械強(qiáng)度要求,，生物相容性,、生物降解性、抗菌性和抗氧化能力更出色,，能通過(guò)強(qiáng)大的成骨 - 血管生成作用,，促進(jìn)糖尿病骨缺損的修復(fù)(圖1)。

圖 1. 活性肽-金屬離子-骨水泥三重集成3D打印復(fù)合支架示意圖用于糖尿病骨缺損的骨血管再生修復(fù),。GMs：明膠微凝膠,；P2：甲狀旁腺激素相關(guān)肽-2；GP：負(fù)載P2的GM,；Alg：海藻酸鹽,；STZ：鏈脲佐菌素；ROS：活性氧,；MMP：線粒體膜電位,；OB：成骨細(xì)胞；BMSC：骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞,；VEC：血管內(nèi)皮細(xì)胞,。

二、材料與方法

2.1 3D打印TZGP復(fù)合支架的制作

將α-TCP粉末(3g),、ZnONPs(2% w/v)和GMs(5% w/v)或GPs(5%w/v)加入10% w/v Alg凝膠中,。進(jìn)行機(jī)械攪拌直至形成糊狀以獲得打印墨水。根據(jù)表1中的組成制備四種不同的復(fù)合支架,，T,、TZ、TZG和TZGP支架,。復(fù)合支架在3D打印機(jī)(SunP BioMaker 2)上打印,。3D打印機(jī)噴嘴直徑為500 μm，螺桿擠出速度為0.5-1 mm3s-1,，打印速度為5-15 mm-1 s-1,。將打印好的支架毛坯浸入10%磷酸溶液中5分鐘進(jìn)行交聯(lián)反應(yīng)，然后用去離子水沖洗3次,，快速真空干燥,，并在-20°C下儲(chǔ)存。

三、結(jié)果

3.1 3D 打印復(fù)合支架的表征

本研究以GM作為P2的藥物遞送載體,，在3D打印復(fù)合支架的制備過(guò)程中,，為P2提供保護(hù)殼。GM的制備如圖2A所示,，交聯(lián)前的明膠粉末呈較大尺寸的不規(guī)則塊狀(圖2B),。成功制備的GM為規(guī)則、多孔的球形小顆粒(圖2B),。 粒徑分布范圍為10–70 μm，集中在35–50 μm,，平均直徑為41.33 ± 9.13 μm(圖2C),。

α-TCP無(wú)毒、具骨傳導(dǎo)性和生物活性,，降解吸收快,。TCP/ZnONP/GM (TZG)復(fù)合支架在室溫下的制備過(guò)程如圖2D所示。流變測(cè)試顯示其打印油墨高粘度低剪切力,，有良好自修復(fù)能力和剪切變稀特性,，具備可擠出性和可打印性(圖2E、2F),。X射線衍射儀(XRD)結(jié)果表明,，凝固的純?chǔ)?TCP(T)支架中的主要晶相為磷灰石。TZ和TZG復(fù)合支架的特征峰與純TCP支架的特征峰基本相同,，說(shuō)明ZnONPs和GM的加入對(duì)TCP的固化產(chǎn)物沒(méi)有影響(圖2G),。

T支架的初始降解產(chǎn)物呈弱酸性，而ZnONP是堿性物質(zhì),，可與H+反應(yīng)釋放Zn2+,。連續(xù) pH測(cè)定表明，ZnONP的引入略微增加了TZ的pH值,，并且TZG支架,。TZ和TZG支架的pH值比T支架更接近中性和生理環(huán)境(圖2H)。Zn2+的釋放動(dòng)力學(xué)表明,，TZ和TZG支架在前3周內(nèi)均可穩(wěn)定釋放Zn2+(圖2I),。TZG支架釋放的Zn2+濃度略高于TZ支架。連續(xù)8周的測(cè)試表明,，所有三組支架均表現(xiàn)出正降解,。與T和TZ支架相比，TZG支架表現(xiàn)出更好的降解效果(圖2J),。這可能是因?yàn)橐�入GM導(dǎo)致TZG的降解速度略快于TZ支架,。SEM結(jié)果顯示了TZG支架隨時(shí)間降解后的形態(tài)。支架降解后，支架內(nèi)部的GM會(huì)顯露出來(lái),，為新生骨組織提供攀爬和交聯(lián)的空間,。打印支架浸入弱酸性溶液中發(fā)生的凝固反應(yīng)為支架提供了基本的機(jī)械強(qiáng)度。在α-TCP凝固過(guò)程中,，溶解的Ca2+會(huì)與支架中的海藻酸鈉螯合,，進(jìn)一步增強(qiáng)支架的機(jī)械強(qiáng)度。TZ支架的抗壓強(qiáng)度(23.34 ± 1.80 MPa)與T支架(24.17 ± 1.55 MPa)相比沒(méi)有明顯變化,，而TZG的抗壓強(qiáng)度(14.53 ± 1.27 MPa)下降更為明顯(圖2K),。GM的引入可能會(huì)降低支架的致密性，可能是復(fù)合支架機(jī)械性能下降的原因,。幸運(yùn)的是,，它仍然能夠滿足松質(zhì)骨的要求(4-12 MPa)。通過(guò)顯微鏡連續(xù)觀察發(fā)現(xiàn),，由于吸水,，PBS中的GM直徑增大，然后逐漸降解,，28天內(nèi)降解率超過(guò)90%,，僅剩下少量顆粒。

ZnONPs是強(qiáng)效抗菌劑,，可直接損傷細(xì)菌細(xì)胞膜上的蛋白質(zhì)和脂質(zhì),，導(dǎo)致細(xì)菌細(xì)胞內(nèi)內(nèi)容物泄漏和死亡。ZnONPs和Zn2+還可以穿過(guò)受損的膜,，破壞細(xì)胞內(nèi)部功能,，導(dǎo)致細(xì)菌死亡。根據(jù)SEM圖像,，ZnONPs的平均粒徑為30.33 ± 7.30 nm,。在本研究中，通過(guò)擴(kuò)散板法驗(yàn)證了ZnONPs的引入賦予TZ和TZG支架一定的抗菌性能(圖2L),，這有利于預(yù)防糖尿病骨缺損中的局部細(xì)菌感染,。

圖2. T、TZ和TZG支架的表征,。A) GM制備示意圖,。B)明膠和GM的SEM。C) GM的粒度分布,。D) TZG支架制備示意圖,。E、F) TZG墨水的流變測(cè)試,。G) XRD和H) T,、TZ和TZG支架的pH值(n = 3),。I) TZ和TZG支架中Zn2+的釋放動(dòng)力學(xué)(n = 3)。J)降解曲線(n = 5),、K)抗壓強(qiáng)度(n = 5)和L) T,、TZ和TZG支架的抗菌性能測(cè)試。

3.2 復(fù)合支架的生物相容性

研究發(fā)現(xiàn),，ZnONPs能通過(guò)重新分配電子密度展現(xiàn)強(qiáng)大抗氧化活性,。在本研究中，TZ 和 TZG支架的氮自由基清除能力比T支架顯著提高,，說(shuō)明ZnONPs賦予復(fù)合支架抗氧化性,。

P2負(fù)載示意圖如3A所示。利用GM的溶解性,、多孔性和吸附特性,，將P2摻入GM(GP)中。P2的平均負(fù)載效率為95.38% ± 1.37%,。通過(guò)免疫熒光顯微鏡可以看到負(fù)載有異硫氰酸熒光素(FITC)標(biāo)記的P2(P2FITC)的GP發(fā)出明亮均勻的綠色熒光(圖3A)，并且GP保持相對(duì)規(guī)則的球形,。傅里葉變換紅外光譜(FTIR)結(jié)果表明,，GM和GP都在1700–1500 cm-1區(qū)域形成了兩個(gè)不同的酰胺I和酰胺II帶。此外,，GP在1540和1453 cm−1處的振動(dòng)峰更加突出,，并且伯酰胺基團(tuán)的NH2的搖擺振動(dòng)更加明顯，出現(xiàn)在≈1158和594 cm−1,。zeta電位測(cè)量表明P2帶負(fù)電荷,，GM帶正電荷，GP的正電荷減少,，這意味著P2在GM上的錨定進(jìn)一步通過(guò)正負(fù)電荷之間的靜電吸引力得到加強(qiáng),，從而促進(jìn)了P2從GP中緩慢釋放(圖3B)。P2從GP中的釋放曲線在前5天內(nèi)表現(xiàn)出初始快速釋放階段,，隨后是緩慢釋放期(圖2C),。

GP與GM在形態(tài)上沒(méi)有差異，GM本身不具有生物活性,，因此后續(xù)分析僅對(duì)T,、TZ和TZGP支架進(jìn)行了評(píng)估。從宏觀角度看,，ZnONPs的加入使支架的顏色更白,，而GP的加入使支架的顏色略帶黃色(圖3D)。SEM結(jié)果顯示,，與T和TZ支架相比,，TZGP支架表面更粗糙,，形成更多的微孔結(jié)構(gòu)(圖3E、H),，有利于細(xì)胞粘附和增殖,。從一些微孔結(jié)構(gòu)中可以觀察到嵌入的GP(圖3F)，這為P2的釋放提供了窗口,。得益于C端三個(gè)連續(xù)谷氨酸的改善,，P2的鈣磷基質(zhì)錨定能力增強(qiáng)(圖3N)。這無(wú)疑有利于P2在支架和骨組織局部的作用時(shí)間,，延長(zhǎng)半衰期,。EDS結(jié)果顯示TZGP支架內(nèi)Ca、P,、Zn分布均勻(圖3G),。

活/死細(xì)胞染色結(jié)果顯示3 組支架共培養(yǎng)3天后活細(xì)胞比例超90%(圖3I、J),，表明均具有良好的生物相容性,。但TZ和TZGP組骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BMSCs)平均鋪展面積大于T組(圖3K、L),，表明TZ和TZGP支架更利于細(xì)胞黏附,。CCK - 8結(jié)果表明，TZGP組細(xì)胞增殖比T和TZ組更明顯(圖3M),。

圖3. 支架的生物相容性,。A) GP示意圖及免疫熒光圖。B) P2,、GMs,、GP的Zeta電位。C) P2釋放曲線及GM降解曲線,。D) 支架宏觀形貌及E) SEM,。F) 光學(xué)顯微鏡下的TZGP支架。箭頭指向GP,。G) TZGP支架的EDS,。H) TZGP支架局部放大SEM圖像。箭頭指向GP,。I)活/死細(xì)胞染色及J)細(xì)胞活力定量分析(活細(xì)胞比例=綠細(xì)胞/(綠細(xì)胞+紅細(xì)胞)× 100%),。K)細(xì)胞骨架熒光染色及L) BMSCs平均擴(kuò)散面積。M) 干預(yù)1天和3天后不同支架組BMSCs的增殖情況,。 N) GP釋放的P2在局部鈣磷基材料和骨組織上的錨定示意圖,。

3.3 變換的支架的犧牲模板以創(chuàng)建3D分支通道

通過(guò)增殖、遷移,、成骨分化以及基因和蛋白質(zhì)表達(dá)譜評(píng)估復(fù)合支架對(duì)BMSCs的功能調(diào)節(jié)作用,。根據(jù)EdU結(jié)果顯示,，高糖微環(huán)境抑制BMSCs增殖，T組改善效果不佳,，TZ組和TZGP組能一定程度恢復(fù)其增殖活力,，TZGP組尤為顯著(圖4A、B),。Transwell實(shí)驗(yàn)顯示,，高糖微環(huán)境下BMSCs的遷移能力降低，T,、TZ,、TZGP支架組細(xì)胞遷移能力依次增強(qiáng)(圖4C、D),。β-TCP支架降解后釋放的Ca,、P離子可促進(jìn)BMSCs向細(xì)胞表面遷移。刺激并積極募集BMSCs,。Zn2+ 可以促進(jìn)BMSCs在早期成骨過(guò)程中的粘附和增殖,。P2是一種高活性的PTH相關(guān)肽，具有強(qiáng)大的募集BMSCs和促進(jìn)增殖的能力,。這使得TZGP在高糖環(huán)境中對(duì)BMSCs具有卓越的保護(hù)能力,。

通過(guò)ALP染色(圖4E、F),、茜素紅S(ARS)染色(圖4G、H)和Von Kossa染色(圖4I,、J)評(píng)估高糖成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基中BMSCs的成骨分化情況,。RT-qPCR檢測(cè)成骨相關(guān)基因ALP、OCN,、Col-I和RUNX2的表達(dá)(圖4K-N),，以免疫熒光結(jié)果呈現(xiàn)細(xì)胞中RUNX2和OCN的蛋白表達(dá)(圖4O-R)。結(jié)果表明TZ組成骨誘導(dǎo)能力優(yōu)于T組,，但TZGP組的ALP活性和鈣沉積面積明顯優(yōu)于TZ組,，且更明顯刺激成骨相關(guān)基因和蛋白的表達(dá)。這種增強(qiáng)的成骨活性可以歸因于幾個(gè)方面,。首先,，TCP支架的降解為BMSCs的成骨分化提供了Ca和P。其次,，Zn2+通過(guò)促進(jìn)成骨相關(guān)基因的表達(dá),，增強(qiáng)成骨分化、膠原合成和礦物質(zhì)沉積,，在成骨分化中發(fā)揮重要作用,。PTH是一種重要的Ca-P調(diào)節(jié)劑,，參與調(diào)節(jié)骨形成/吸收的代謝平衡。課題組開發(fā)的P2通過(guò)在C端引入三重谷氨酸,，能夠增強(qiáng)P2尾端羧基與TCP支架上Ca2+的錨定程度,，暴露肽活性位點(diǎn)；并在PTH的N端絲氨酸上引入磷酸功能團(tuán),。這些改進(jìn)顯著增強(qiáng)了PTH的礦化促進(jìn)作用,，使骨代謝平衡向骨積累方向傾斜。

先前的研究表明,，能控釋Zn²⁺的復(fù)合支架和PTHrP1功能修飾的支架,，分別通過(guò) Wnt/β-catenin和絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)通路促進(jìn)成骨修復(fù)。此外,，p38 MAPK信號(hào)通路是PTH改善成骨作用的調(diào)控途徑,。在本研究中,，經(jīng)免疫熒光染色和Elisa實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證,，TZGP 支架可顯著上調(diào)p-p38 MAPK和β-catenin表達(dá)水平,，說(shuō)明Wnt/β-catenin和p38 MAPK通路可能參與TZGP促進(jìn)成骨修復(fù)的過(guò)程,。因此,，本研究通過(guò)Ca-P無(wú)機(jī)材料,、Zn2+,、P2三重正效應(yīng)疊加的創(chuàng)新設(shè)計(jì),，使TZGP支架實(shí)現(xiàn)了更高效的成骨作用,。

圖 4. 支架對(duì)BMSCs募集和成骨分化的影響,。A,、B)第3天BMSCs的EdU染色和C,、D) Transwell測(cè)定。E,、F)第14天的ALP染色。G,、H)第21天的ARS染色和I,、J) Von Kossa染色,。BMSCs的K) OCN、L) Col-I,、M) ALP和N)RUNX2的mRNA表達(dá),。通過(guò)免疫熒光染色檢測(cè)BMSCs中O,、P)RUNX2和Q,、R) OCN的表達(dá)水平,。

3.4 TZGP支架促進(jìn)高糖微環(huán)境下HUVECs的血管生成

骨組織血管網(wǎng)絡(luò)為成骨提供關(guān)鍵支持,，血管生成對(duì)骨組織工程支架再生特性意義重大,。高血糖微環(huán)境中，過(guò)量ROS和AGEs積累致微血管病變,，影響糖尿病患者骨缺損部位血管重建,。EdU染色(圖5A、B)和Transwell測(cè)定(圖5C,、D)顯示,，高糖組HUVECs增殖和遷移能力受損,，T組干預(yù)無(wú)效，TZ組稍有緩解,，TZGP組顯著改善,。

劃痕愈合實(shí)驗(yàn)同樣證實(shí)了TZGP組HUVECs具有較好的遷移愈合能力(圖5G,、H),。管形成實(shí)驗(yàn)顯示,，在高G組中僅形成少數(shù)血管樣結(jié)構(gòu)，在T和TZ組的HUVECs中形成少量間歇性血管,，而在TZGP組中形成豐富的連續(xù)血管網(wǎng)(圖5E,，F(xiàn)),。說(shuō)明P2的添加使復(fù)合支架具有高效的血管形成能力,。免疫熒光實(shí)驗(yàn)顯示,，TZGP支架顯著促進(jìn)細(xì)胞中血管生成相關(guān)因子CD31,、HIF-1α、VEGF的表達(dá)(圖5I-N),。qRT-PCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn)TZGP組血管生成相關(guān)基因CD31,、VEGF、HIF-1α,、bFGF的表達(dá)水平顯著升高,。這些結(jié)果表明TZGP支架可以通過(guò)上調(diào)HIF-1α/VEGF等通路蛋白的表達(dá)，促進(jìn)高糖環(huán)境下HUVECs的增殖和遷移,，促進(jìn)血管網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建,。

圖 5. 支架對(duì)HUVECs血管生成分化的影響。A,、B)第3天的HUVECs EdU染色和C,、D)Transwell實(shí)驗(yàn)。E,、F) HUVECs 管腔形成的鑒定,。G、H) 劃痕實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了 HUVECs的遷移修復(fù)能力,。通過(guò)免疫熒光染色檢測(cè)HUVECs中I,、J) CD31、K,、L)VEGF和M、N)OCN的表達(dá)水平,。

3.5 TZGP 支架在高糖環(huán)境中保護(hù)線粒體

采用免疫熒光法檢測(cè)高糖環(huán)境下的DNA損傷情況。結(jié)果顯示,，High-G組BMSCs和HUVECs中DNA損傷標(biāo)志物γ-H2AX表達(dá)明顯，而細(xì)胞核中分裂增殖標(biāo)志物Ki67的表達(dá)明顯下調(diào)(圖6A~D、I~L),。TZ組γ-H2AX和Ki67的表達(dá)均有所改善，在BMSCs中改善更為明顯,，但與對(duì)照組仍有明顯差異。TZGP組BMSCs和HUVECs細(xì)胞核中γ-H2AX的表達(dá)明顯減少,，而Ki67的表達(dá)較T組和TZ組有所改善,。線粒體對(duì)維持代謝和骨細(xì)胞分化至關(guān)重要，高糖卻會(huì)破壞其動(dòng)態(tài)穩(wěn)態(tài),。此外,，線粒體是細(xì)胞內(nèi)ROS的主要來(lái)源,，而ROS又是線粒體分裂的強(qiáng)效誘導(dǎo)物，過(guò)量的ROS可誘導(dǎo)線粒體分裂,。糖尿病介導(dǎo)的Adv過(guò)多的ROS產(chǎn)生會(huì)影響種植體的骨整合。本研究中的JC-1熒光探針實(shí)驗(yàn)顯示,，與High-G組相比，TZ和TZGP組的線粒體膜電位有所改善,，尤其是TZGP組，而BMSCs的改善更為顯著(圖6E,、F,、M,、N),。此外,，用熒光探針二氫乙錠(DHE)檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)ROS的表達(dá)(圖6G,、H、O,、P)。與High-G組相比,，TZ組BMSCs的ROS生成顯著減少,。然而,，HUVECs中ROS的積累減少,。與其他支架組相比,，TZGP組的細(xì)胞內(nèi)ROS生成顯著減少,。

通過(guò)DPPH試驗(yàn),、ABTS試驗(yàn)、羥基自由基清除試驗(yàn),、超氧化物自由基清除試驗(yàn),、過(guò)氧化氫自由基清除試驗(yàn)和鐵還原抗氧化能力試驗(yàn)等實(shí)驗(yàn)評(píng)估表明ZnONPs具有強(qiáng)大的自由基清除能力,。本研究還證實(shí)，ZnONPs的添加增強(qiáng)了復(fù)合支架清除DPPH和ABST自由基的能力。假設(shè)TZ支架中的ZnONPs清除了微環(huán)境中的自由基,，并中斷了ROS積累引起的正反饋毒性，從而發(fā)揮了一定的抗氧化應(yīng)激作用,，部分改善了TZ組細(xì)胞的線粒體膜電位并下調(diào)了細(xì)胞內(nèi)ROS的產(chǎn)生,。Zn2+對(duì)BMSCs的增殖和分化有明顯的保護(hù)作用，這可能是TZ組BMSCs和HUVECs處理存在差異的潛在原因之一,。此外,，有證據(jù)表明PTH通過(guò)增強(qiáng)DNA修復(fù)來(lái)抑制細(xì)胞凋亡,。PTHrP可通過(guò)其N端和骨抑制結(jié)構(gòu)域減少成骨細(xì)胞中的ROS產(chǎn)生,，并通過(guò)調(diào)節(jié)MAPK活化來(lái)減弱ROS誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。與PTH(1-34)相比,，P2顯著減弱了H2O2誘導(dǎo)的BMSCs和HUVECs線粒體損傷和內(nèi)源性ROS積累,。因此，P2和ZnONPs的雙重保護(hù)作用可能是TZGP支架減輕高糖誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激對(duì)細(xì)胞損傷作用的潛在機(jī)制,。

圖 6. A) BMSCs和B) HUVECs中γ-H2AX的表達(dá),。C) BMSCs和D) HUVECs中Ki67的表達(dá)。通過(guò)JC-1 測(cè)定評(píng)估E)BMSCs和F)HUVECs的線粒體膜電位,。DHE測(cè)定評(píng)估G)BMSCs和H)HUVECs中的細(xì)胞內(nèi)ROS表達(dá),。定量分析I,、J) γ-H2AX、K,、L) Ki67,、M、N) JC-1和O,、P) ROS,。

3.6 產(chǎn)生具有行走運(yùn)動(dòng)的基于水凝膠的生物混合致動(dòng)器

為研究TZGP復(fù)合支架對(duì)糖尿病患者的骨再生作用，構(gòu)建糖尿病骨缺損模型并植入T,、TZ和TZGP支架,。用鏈脲佐菌素誘導(dǎo)5 - 7天后，SD大鼠成功建模,。TZ和TZGP組大鼠血糖略低于T組,，推測(cè)是支架降解釋放的ZnONPs有輕度降血糖作用，但局部釋藥濃度有限,，抗糖尿病效果不顯著,。

術(shù)后6,、12周采用microCT及三維重建分析評(píng)估骨修復(fù)情況,。結(jié)果顯示，DM組糖尿病骨缺損部位骨量較少,，僅積聚于缺損邊緣,，由于缺乏支架支撐，組織向缺損內(nèi)部遷移緩慢,，難以形成新骨,。與DM組明顯不同的是，TZGP組骨缺損部位礦化骨組織生成較多,，支架表面及間隙中覆蓋更多新生骨,。同時(shí)，TZGP組支架降解較T組更明顯,，促進(jìn)新生骨組織逐漸爬入(圖7A),。此外，TZGP組在冠狀面,、矢狀面及橫斷面支架周圍均可見較多黃綠色骨組織,，而T組可見較多藍(lán)色支架結(jié)構(gòu)(圖7B)。與這些結(jié)果一致的是,，TZGP組的骨微結(jié)構(gòu)參數(shù),，如骨體積(BV)、骨體積分?jǐn)?shù)(BV/TV),、骨小梁數(shù)量(Tb.N)和骨小梁厚度(Tb.Th)明顯優(yōu)于其他組 (圖7C-E),。三個(gè)支架組之間的骨小梁間距(Tb.Sp)沒(méi)有顯著差異,，但小于對(duì)照組(圖7F)。這些結(jié)果表明TZGP支架可以顯著促進(jìn)糖尿病骨缺損中的骨再生,。

圖 7. 微型CT修復(fù)糖尿病骨缺損的評(píng)估,。A)局部糖尿病骨缺損的3D重建。B)植入6周和12周時(shí)支架周圍新生骨組織的分布,。新骨呈黃綠色,，支架呈藍(lán)紫色。各組治療后骨微結(jié)構(gòu)參數(shù),，包括C) BV/TV,、D) Tb.N、E) Tb.Th和F) Tb.Sp,。

通過(guò)在兩個(gè)不同的時(shí)間間隔進(jìn)行HE染色,，可以更直觀地觀察到三組支架周圍形成了連續(xù)的新生組織環(huán)。然而,，DM組的缺損區(qū)域僅覆蓋了一層相對(duì)較薄的組織(圖8A),。TZGP組支架降解最多，新生組織豐富,，填充在支架周圍和間隙(圖8A,、B)，橙色的新生骨組織比其他組更豐富(圖8A),。相比之下,，T組支架內(nèi)部在6周時(shí)尚未明顯被新生組織填充(圖8A)。

Masson染色結(jié)果與HE結(jié)果一致,，TZGP組支架內(nèi)及周圍有更多紅色和藍(lán)色的新生骨組織(圖8C,、D)。然而,，DM組新骨形成很少部分樣本中甚至出現(xiàn)骨缺損邊緣的明顯骨吸收現(xiàn)象,。支架中心區(qū)域因內(nèi)部保護(hù)作用存在未降解的GP顆粒，而支架-組織界面區(qū)域的GP則被包埋組織降解(圖8A,、C),這表明明膠微球可通過(guò)位置差異實(shí)現(xiàn)P2在時(shí)間和空間上的緩慢釋放,。RUNX2、Col-I,、CD31和HIF-1α的IHC染色反映了成骨和血管生成相關(guān)因子的表達(dá)(圖8E),。RUNX2是早期成骨的重要轉(zhuǎn)錄因子，其在TZGP組中的表達(dá)更為顯著,，尤其是在支架-新生組織連接處,。這表明TZGP支架保持了良好的成骨活性(圖8E、F)。Col-I是骨組織中的主要膠原成分,。與DM和T組相比,，TZ和TZGP組形成的膠原結(jié)構(gòu)更豐富、更致密(圖8E,、G),。此外，TZGP組中HIF-1α表達(dá)更顯著,，對(duì)成骨和血管生成分化均起正向調(diào)控作用(圖8E,、J)。CD31標(biāo)記可見各組支架周圍新生血管(圖8E,、H,、I)。TZ組血管生成較T組更活躍,，且其體內(nèi)促血管活性顯著優(yōu)于體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果(圖5E,、8E)。原因是TZ支架改善局部微環(huán)境,、體內(nèi)存在細(xì)胞間信號(hào)串?dāng)_,，而Zn²⁺可通過(guò)調(diào)控BMSCs(骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞)促進(jìn)形成新生血管。TZGP組新生血管比TZ組更多,，得益于支架控釋P2的促血管生成效應(yīng),。總之,，用ZnONPs和P2修飾的TZGP支架可以加速糖尿病骨缺損的血管生成和成骨修復(fù),。

圖 8. 糖尿病骨缺損修復(fù)的組織學(xué)評(píng)估,。A)糖尿病骨缺損再生的HE染色,。黃色箭頭指向GP。B)12周時(shí)T,、TZ和TZGP組的支架和新生組織的百分比,。與T組相比****p < 0.0001；與TZ組相比###p < 0.001,。C)糖尿病骨缺損再生的Masson三色染色,。黃色箭頭指向GP。D)12周時(shí)Masson染色結(jié)果中新骨面積的百分比,。E)植入12周時(shí)RUNX2,、Col-I、CD31和HIF-1α的IHC染色,。箭頭指向新生血管,。F) RUNX2、G) Col-I 和J) HIF-1α相對(duì)表達(dá)的半定量分析。H)血管面積和I)血管數(shù)量的半定量分析,。

本研究在細(xì)胞和小動(dòng)物水平驗(yàn)證了TZGP復(fù)合支架的有效性,，為進(jìn)一步推廣至臨床試驗(yàn)奠定了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)，但仍有一些方向需要進(jìn)一步探索,。首先,，本研究發(fā)現(xiàn)TZGP支架相較于α-TCP支架具有更好的生物降解性，未來(lái)的研究可以致力于開發(fā)降解速率與骨組織再生同步的支架,。其次,，雖然我們初步驗(yàn)證了TZGP能夠調(diào)控p38 MAPK和Wnt/β-catenin信號(hào)通路，但必須指出的是,，復(fù)合支架在局部骨缺損區(qū)域的影響是多方面的,，多種類型的細(xì)胞都會(huì)受到支架的調(diào)控。最后,，雖然在支架中引入ZnONPs能夠輕微調(diào)節(jié)血糖,，但后續(xù)研究應(yīng)該進(jìn)一步探索局部釋放ZnONPs對(duì)全身血糖調(diào)節(jié)的可能和潛在機(jī)制。

四,、結(jié)論

糖尿病患者的高血糖微環(huán)境可引發(fā)氧化應(yīng)激等毒性病理因素,，對(duì)局部骨再生和骨缺損的血管化修復(fù)帶來(lái)挑戰(zhàn)。本研究通過(guò)P2,、ZnONPs和α-TCP三者巧妙組合,，構(gòu)建了一種具有可降解、抗菌,、抗氧化,、高骨誘導(dǎo)和血管擴(kuò)張活性的3D打印TZGP復(fù)合支架。 這種新型TZGP支架各組分優(yōu)勢(shì)互補(bǔ),，明顯改善了傳統(tǒng)純?chǔ)?TCP支架降解速度慢,、缺乏活性肽、有酸性降解產(chǎn)物等不利因素,。體外實(shí)驗(yàn)證實(shí),，TZGP支架可改善高糖微環(huán)境下BMSC和HUVEC的DNA損傷和線粒體損傷，減少ROS積累,。TZGP支架釋放的Zn2+和P2通過(guò)促進(jìn)成骨相關(guān)因子RUNX2,、OCN、ALP,、Col I的表達(dá),，加速成骨分化和鈣鹽沉積；同時(shí),，TZGP支架能通過(guò)促進(jìn)VEGF,、CD31,、bFGF、HIF-1α等生物因子的表達(dá),，有效重建血管網(wǎng)絡(luò),。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)證實(shí)，TZGP復(fù)合支架能促進(jìn)糖尿病骨缺損處的組織填充和骨血管再生,。因此,，本研究采用的活性肽、金屬離子和無(wú)機(jī)Ca-P材料相結(jié)合的策略,，為難治性糖尿病骨缺損的修復(fù)提供了一種新的設(shè)計(jì),。

五、參考文獻(xiàn)

J. Wang, Y.Xia, Z. Hao, G. Shi, Q. Zhang, C. Wang, M. Zhu, Y. Huang, L. Guo, T. Luan, T.Zhu, H. Dai, J. Li, A Triple-Integrated 3D-Printed Composite Scaffold ofHigh-Activity Peptide-Metal Ion-Bone Cement Facilitates Osteo-VascularRegenerative Repair of Diabetic Bone Defects. Adv. Funct. Mater. 2025, 2422950.https://doi.org/10.1002/adfm.202422950