湖南大學(xué)韓曉筱課題組：新型光散射抑制機(jī)制助力高保真光固化生物3D打印

來源：摩方高精密

光固化生物3D打印技術(shù)（如：數(shù)字光處理,，DLP）可精確控制細(xì)胞和生物材料在空間中的分布,，以此構(gòu)建復(fù)雜幾何結(jié)構(gòu),，被廣泛應(yīng)用于組織工程,、藥物篩選,、外科植入物等生物醫(yī)學(xué)研究領(lǐng)域。然而,，在DLP打印過程中,，光在固液兩相界面會(huì)產(chǎn)生物理散射，細(xì)胞的混入會(huì)加劇此種散射效應(yīng),，導(dǎo)致水凝膠在非目標(biāo)區(qū)域固化，降低了打印精度,，使眾多生物性能優(yōu)異且具有小尺度特征（如血管網(wǎng)絡(luò)和薄壁結(jié)構(gòu)等）的復(fù)雜結(jié)構(gòu)難以成型,，限制了DLP打印技術(shù)在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用。針對(duì)這一挑戰(zhàn),，湖南大學(xué)機(jī)械與運(yùn)載工程學(xué)院韓曉筱教授等提出了一種光吸收與自由基反應(yīng)協(xié)同作用的光散射抑制新機(jī)制,，并基于此機(jī)制開發(fā)了一種新型光抑制劑（Curcumin-Na，Cur-Na）,，降低了載細(xì)胞水凝膠光固化打印過程中的光散射效應(yīng),，將打印精度提高到1.2-2.1像素點(diǎn)，幾何誤差低于5%,，成功制造了各種具有多尺度通道和薄壁網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)的生物活性功能支架,。此外,，該方法具有較寬的打印參數(shù)窗口，極大地縮短了參數(shù)優(yōu)化過程,。相關(guān)研究成果以題為"Photoinhibition via simultaneously photoabsorption and free-radical reaction for high-fidelity light-based bioprinting"的文章發(fā)表在《Nature Communications》（SCI一區(qū),，Top期刊，IF=17.69）,。湖南大學(xué)博士研究生賀寧為第一作者,，湖南大學(xué)機(jī)械與運(yùn)載工程學(xué)院韓曉筱教授和陳鋒副教授為通訊作者。

水凝膠生物墨水中傳統(tǒng)的光吸收劑能夠吸收過量的光能量,，防止打印層厚過厚,，從而在一定程度上提高垂直方向上的打印精度。然而,，傳統(tǒng)的光吸收劑難以解決由光散射引起的水平方向上過固化的問題,。因此，該研究提出了光吸收與自由基反應(yīng)協(xié)同作用的光抑制機(jī)制：保留傳統(tǒng)光吸收劑功能的同時(shí)并能“搶奪”水平方向上散射光激發(fā)的自由基,，抑制散射區(qū)域的自由基與水凝膠發(fā)生聚合反應(yīng),，防止非目標(biāo)區(qū)域的固化，從而提高水平方向上的打印精度和保真度,�,；�于此機(jī)制，該團(tuán)隊(duì)首先成功開發(fā)了一種新型光抑制劑（Cur-Na）（如圖1）,，其具有良好水溶性和生物相容性,。接著，該團(tuán)隊(duì)制備了含不同光抑制劑的PEG-GelMA生物墨水,，通過研究生物墨水的物化性質(zhì)評(píng)價(jià)了其可打印性和機(jī)械性能（如圖2）,。然后通過理論和實(shí)驗(yàn)研究聚合過程，揭示了Cur-Na減輕散射效應(yīng)的機(jī)制（如圖3）：Cur-Na的吸收峰位于425nm附近,，非常接近光源波長,，可以作為典型的光吸收劑降低光穿透深度。同時(shí),，Cur-Na 可以通過更高的反應(yīng)速率競爭性地?fù)寠Z自由基來阻止水凝膠單體聚合形成固化水凝膠,。再者，Cur-Na 的反應(yīng)產(chǎn)物為液體,，避免了非目標(biāo)區(qū)域的固化,。由于 Cur-Na 的高反應(yīng)性速率，固定濃度的 Cur-Na 可以在很寬的光強(qiáng)度范圍內(nèi)抑制散射效應(yīng),，避免在打印不同結(jié)構(gòu)的時(shí),，打印參數(shù)再次優(yōu)化，提高打印效率。文章中,，圖4和圖5定量研究了加入Cur-Na后的生物墨水的打印分辨率和圖案保真度,，以驗(yàn)證Cur-Na在解決光散射效應(yīng)方面的有效性。之后,，團(tuán)隊(duì)將添加了Cur-Na的生物墨水應(yīng)用到摩方精密 microArch S140光固化打印機(jī)中,，成功地制造了各種復(fù)雜結(jié)構(gòu)體（仿生支架，可灌注血管網(wǎng)絡(luò),，極小三周期曲面等）,，證明了該光抑制劑在制造具有小尺度特征的功能性載細(xì)胞三維支架方面的卓越能力（如圖6）。圖7進(jìn)一步證明了此生物墨水在組織工程中的適用性,。

圖1. 姜黃鈉的合成,。a. 用姜黃素和碳酸氫鈉合成姜黃素鈉（Cur-Na）的過程。姜黃素分子中酚羥基的H+被Na+取代（紅色橢圓）,，而姜黃素中的羰基鍵發(fā)生酮-烯醇互變異構(gòu)（藍(lán)色橢圓）,。b. 姜黃素和Cur-Na的1H-NMR光譜，顯示了合成過程中發(fā)生的化學(xué)性質(zhì)的代表性變化,。藍(lán)色陰影區(qū)域表示酚羥基的特征共振（δ=9.65ppm）,。綠色陰影是烯烴信號(hào)（δ=5.93ppm），表明C=C雙鍵的形成,。

圖2. 生物墨水的物化性質(zhì),。添加了不同濃度光抑制劑的生物墨水（PEG-GelMA/LAP）的儲(chǔ)能模量（G'反映材料的剛度）和損失模量（G''反映材料粘度）隨時(shí)間的變化：a.檸檬黃和b. Cur-Na。G'和G'之間的交叉點(diǎn)被稱為凝膠點(diǎn),，而凝膠時(shí)間被定義為曝光開始至凝膠點(diǎn)的時(shí)間（在該研究中約為20秒）,。生物墨水在405nm、13mW cm−2的光照下曝光30s,。陰影區(qū)域表示曝光時(shí)間,。c. 水凝膠的應(yīng)力-應(yīng)變曲線。d. 三種水凝膠在~20%應(yīng)變下的彈性模量,。三種生物墨水的e. 溶脹比和f. 溶膠分?jǐn)?shù)對(duì)比,。

圖3. Cur-Na抑制散射效應(yīng)的機(jī)制。a. 示意圖顯示了當(dāng)光穿透生物墨水時(shí)光強(qiáng)的高斯分布以及不同情況下產(chǎn)生的固化區(qū)域,，包括無散射,、有散射、與細(xì)胞混合的生物墨水和添加Cur-Na的生物墨水,。Cd和Cw分別是固化深度和固化寬度。E0表示生物墨水表面的光強(qiáng)度,，而EC是引發(fā)聚合所需的臨界能量,。b. Cur-Na自由基鏈生長聚合的動(dòng)力學(xué)過程由三個(gè)階段控制：（1）引發(fā)、（2）鏈傳播,、（3）（4）終止,。ki,，kp，ktc和ktd分別是四種反應(yīng)中的速率常數(shù),。每個(gè)Cur-Na與三個(gè)自由基（R·）反應(yīng),，引發(fā)聚合物鏈生長，形成單體（M）,。激活后的單體可以與其他單體反應(yīng),，聚合物鏈通過傳播而增長，形成Mn·和Mm·,。當(dāng)鏈傳播通過終止反應(yīng)終止時(shí),，形成聚合物（Mn和Mm）。c. Cur-Na和PEGDA聚合過程中官能團(tuán)的轉(zhuǎn)化率與時(shí)間的關(guān)系,。散射區(qū)域的自由基可以被Cur-Na快速消耗,；水凝膠單體由于缺乏自由基而難以在散射區(qū)域形成聚合物。

圖4. 水平方向打印精度分析,。a. 輻條狀圖案用于評(píng)估打印精度,，從中心到外圍相鄰輻條之間的間隙增加。打印精度被定義為模糊區(qū)域直徑（紅色虛線圓圈）與輻條狀圖案直徑的比值,。b. 載細(xì)胞結(jié)構(gòu)的熒光染色圖,。c. 打印結(jié)構(gòu)的顯微圖像，顯示了純PEG-GelMA生物墨水（上）和添加了檸檬黃（中）和Cur-Na的生物墨水（下）的模糊區(qū)域（紅色虛線圓圈）大小與相對(duì)曝光能量的關(guān)系,。Er指相對(duì)能量,，定義為實(shí)際光能與單位曝光量的比。d. 模糊區(qū)域大小與曝光能量的定量關(guān)系,。e. Cur-Na的高精度打印窗口,，灰色、紅色,、藍(lán)色區(qū)域分別代表含1mM,、2mM、3mM Cur-Na生物墨水的打印窗口寬度,。f. 載細(xì)胞打印結(jié)構(gòu)的模糊區(qū)域大小與曝光能量之間的定量關(guān)系,。

圖5. 多層打印中的中空通道打印性分析與評(píng)定高保真度的打印誤差分析。a. 具有不同直徑（D=300,、500和700μm）通道的圓柱體的3D CAD設(shè)計(jì),。H表示圓柱體的高度，而h1,、h2和h3是通道的中空部分,。打印精度定義為中空部分與通道總長度之間的比率。b. 連續(xù)層打印中的散射效應(yīng)及其引起的過固化現(xiàn)象。c-e. 打印精度隨圓柱體直徑的高度和通道直徑的關(guān)系,。f. 具有不同直徑的多通道結(jié)構(gòu)CAD設(shè)計(jì),。g. 分別使用含Cur-Na和檸檬黃的生物墨水打印的樣品。h. 通道的實(shí)際直徑與設(shè)計(jì)直徑間的差異,。

圖6. Cur-Na在打印生物醫(yī)學(xué)應(yīng)用中常用的復(fù)雜三維結(jié)構(gòu)時(shí)的分辨率和高保真度,。a. 脊髓支架。它的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)呈現(xiàn)不規(guī)則的通道和薄壁網(wǎng)絡(luò),，模仿脊髓的內(nèi)部結(jié)構(gòu),。使用兩種類型的水凝膠成功地制備了支架：PEG-GelMA（10%）和甲基丙烯酸縮水甘油酯改性的絲素蛋白（Sil-MA（15%））。b. 具有多個(gè)分支,、可灌注通道（200-800μm）和薄壁（~100μm）的血管網(wǎng)絡(luò),。通過注射有色染料溶液進(jìn)行灌注。c. 具有獨(dú)特拓?fù)涮卣鳎ㄇ���,、高孔隙率和連通性）的gyroid支架,。d. 打印載HepG2細(xì)胞的gyroid支架并培養(yǎng)14天，展現(xiàn)了良好的細(xì)胞增殖效果,。

圖7. 基于PC-12細(xì)胞體外培養(yǎng)的Cur-Na 細(xì)胞相容性評(píng)價(jià),。a. 細(xì)胞活死染色熒光圖展示了細(xì)胞14天的活力（綠色：活細(xì)胞；紅色：死細(xì)胞）,。b. CCK-8測定細(xì)胞增殖情況,。細(xì)胞在支架中增殖14天，PEG-GelMA/Cur-Na水凝膠中的細(xì)胞展現(xiàn)出最好的增殖效果,。c. 使用PEG-GelMA/Cur-Na水凝膠制造的通道支架（直徑200μm）的熒光圖像顯示了均勻的細(xì)胞分布,。最后一張圖像顯示了細(xì)胞沿著通道的生長情況。d. 第1,、7和14天脊髓支架中通道的共聚焦圖像,。e. 熒光圖像顯示種植在PEG-GelMA/Cur-Na支架表面的PC-12細(xì)胞的分化和突起形成（第7天）。Tuj-1：Beta3-微管蛋白,；DAPI：4’,，6-二胺基-2苯基吲哚。

結(jié)論
該研究提出了一種光吸收和自由基反應(yīng)協(xié)同作用的光抑制新機(jī)制,，有效抑制光輔助3D打印中的光散射效應(yīng),。基于此機(jī)制,，開發(fā)了一種新的光抑制劑（Cur-Na）,，具有以下獨(dú)特優(yōu)勢：（1）顯著提高打印分辨率和保真度：在限制水凝膠的溶脹下，打印精度可接近打印機(jī)理論極限（~1像素）,；（2）具有良好打印參數(shù)適應(yīng)性,，極大簡化了打印參數(shù)優(yōu)化過程,；（3）在制造具有微尺度通道和薄壁等復(fù)雜支架結(jié)構(gòu)上展現(xiàn)出卓越能力，對(duì)于支架內(nèi)營養(yǎng)物質(zhì)的運(yùn)輸和氧氣的滲透具有重要意義,；（4）能成功制造對(duì)光散射效應(yīng)尤其敏感的載細(xì)胞Gyroid支架，且在歷經(jīng)14天的培養(yǎng)后,，支架內(nèi)細(xì)胞展現(xiàn)出良好的增殖態(tài)勢,。（5）此方法可應(yīng)用于其他由自由基鏈生長聚合控制的可光固化墨水中（例如Sil-MA等）。該研究提供的將多尺度特征直接賦予組織結(jié)構(gòu)的方法,，對(duì)于更好地模擬天然組織微環(huán)境至關(guān)重要,。研究中確立的策略提高了生物3D打印高保真復(fù)雜結(jié)構(gòu)的可打印性和可操作性，從而助力更先進(jìn)的組織工程和再生醫(yī)學(xué)應(yīng)用的實(shí)現(xiàn),。

原文鏈接：https://doi.org/10.1038/s41467-023-38838-2