浙江大學(xué)賀永教授等：周?chē)�神�?jīng)再生和脊髓損傷修復(fù)3D打印支架研究進(jìn)展

來(lái)源：極端制造 IJEM
作者：Editorial Office

復(fù)雜的神經(jīng)解剖結(jié)構(gòu)導(dǎo)致長(zhǎng)距離周?chē)�神�?jīng)再生和脊髓損傷修復(fù)一直是一個(gè)巨大挑戰(zhàn)。生物支架通過(guò)支架結(jié)構(gòu)和種子細(xì)胞提供仿生天然組織的結(jié)構(gòu)和功能,，可加速神經(jīng)再生過(guò)程，而3D打印技術(shù)的迅猛發(fā)展使研究人員能夠開(kāi)發(fā)具有復(fù)雜結(jié)構(gòu)和功能多樣的新型3D支架,，實(shí)現(xiàn)結(jié)構(gòu)和功能的高度仿生,。

近期，浙江大學(xué)機(jī)械學(xué)院賀永教授,、東莞理工學(xué)院特聘副教授宋菊青等人在SCI核心期刊《極端制造》（International Journal of Extreme Manufacturing, IJEM）上發(fā)表了題為《Advances in 3D printing scaffolds for peripheral nerve and spinal cord injury repair》的綜述,。論文概述了周?chē)�神�?jīng)和脊髓的解剖結(jié)構(gòu)，以及目前臨床上周?chē)�神�?jīng)損傷（PNI）和脊髓損傷（SCI）的治療策略,。然后討論了周?chē)�神�?jīng)和脊髓組織工程的設(shè)計(jì)要素,，并詳述了適用于神經(jīng)組織工程的多種3D打印技術(shù)。最后重點(diǎn)介紹了3D打印技術(shù)在周?chē)�神�?jīng)再生和脊髓修復(fù)中的應(yīng)用,，包括誘導(dǎo)神經(jīng)分化,、制造神經(jīng)引導(dǎo)導(dǎo)管、建立脊髓神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)和構(gòu)建脊髓樣支架（如圖1）,，以及該研究領(lǐng)域的挑戰(zhàn)和前景,。

亮點(diǎn)
系統(tǒng)概述了神經(jīng)系統(tǒng)的解剖結(jié)構(gòu)、神經(jīng)損傷的當(dāng)前治療策略以及神經(jīng)損傷修復(fù)支架的設(shè)計(jì)要素,。
探討了擠出打印,、立體光固化和面投影打印等3D打印工藝如何有效的構(gòu)建神經(jīng)損傷修復(fù)支架。
歸納總結(jié)了3D打印支架在周?chē)�神�?jīng)再生和脊髓損傷修復(fù)中的最新應(yīng)用,，可以為組織工程神經(jīng)修復(fù)和再生提供新的思路,。

圖1 神經(jīng)支架的設(shè)計(jì)要素、適用的3D打印技術(shù)和典型應(yīng)用

研究背景
神經(jīng)系統(tǒng)損傷可能導(dǎo)致神經(jīng)橫斷和血神經(jīng)屏障破壞,，最終導(dǎo)致疼痛,、感覺(jué)障礙和身心損傷。神經(jīng)橫斷會(huì)導(dǎo)致神經(jīng)元與其支持細(xì)胞之間的通訊中斷,。所有這些損傷都可能發(fā)生在中樞神經(jīng)系統(tǒng)（CNS）和周?chē)�神�?jīng)系統(tǒng)（PNS）中,，而它們的神經(jīng)元對(duì)軸突橫斷的響應(yīng)在其根本上是不同的,。PNS在損傷后具有先天性再生潛力，但對(duì)于間隙長(zhǎng)度大于10 mm的缺陷,，神經(jīng)再生不會(huì)自發(fā)發(fā)生,。目前，修復(fù)長(zhǎng)間隙周?chē)�神�?jīng)損傷（PNI）的臨床標(biāo)準(zhǔn)是使用自體移植物,。然而,，仍存在一些局限性，如供體來(lái)源短缺,、大小不匹配和對(duì)供體部位的永久性損傷等,。與PNS不同，CNS中橫斷的軸突只能產(chǎn)生功能不足的發(fā)芽,，而這幾乎不能提供功能恢復(fù),。目前，通過(guò)藥物治療和康復(fù)訓(xùn)練進(jìn)行姑息性功能恢復(fù)是首選,。然而,，這些方法既不能逆轉(zhuǎn)神經(jīng)損傷，也不能恢復(fù)運(yùn)動(dòng)能力,。組織工程技術(shù)旨在使用工程方法（包括支架,、細(xì)胞以及生物物理和生物化學(xué)信號(hào)）來(lái)替換、修復(fù)或再生受損,、退化或有缺陷的組織,，并在周?chē)�神�?jīng)和脊髓再生方面顯示出潛在的優(yōu)勢(shì)。而3D打印技術(shù)能夠?yàn)樵O(shè)計(jì)和制造組織工程支架提供所需的空間精度,，可以模擬組織結(jié)構(gòu)和材料靈活性,，以匹配天然組織的機(jī)械和化學(xué)特性。3D打印技術(shù)使用可固化的材料和計(jì)算機(jī)控制的工作系統(tǒng)，在設(shè)定的數(shù)字模型指導(dǎo)下，逐層構(gòu)建3D結(jié)構(gòu),，可以很容易地獲得包含生物材料、多種細(xì)胞和/或生長(zhǎng)因子的精細(xì)幾何分布,，并可以提供個(gè)性化的患者特異性治療選擇。本文對(duì)適用于神經(jīng)組織工程的3D打印技術(shù)及其典型應(yīng)用進(jìn)行了詳細(xì)的介紹和總結(jié),。

最新進(jìn)展
3.1. 適用于神經(jīng)組織工程支架的3D打印技術(shù)
3D打印是一系列靈活的增材制造技術(shù),，可以精確地構(gòu)建具有復(fù)雜3D特征的結(jié)構(gòu)。它在設(shè)計(jì)靈活性,、個(gè)性化定制,、結(jié)構(gòu)可靠性和適用材料的多樣性方面具有很大的優(yōu)勢(shì)。作者總結(jié)了神經(jīng)組織工程中廣泛使用的3D打印方法,，包括噴墨打印,、擠出打印、立體光固化,、面投影技術(shù)和一些新興的3D打印技術(shù),。

噴墨打印能夠以高度可控的方式沿著 x、 y 和 z 軸沉積微小的聚合物溶液液滴,，層層累積后在基板上生成所需圖案,。在成型過(guò)程中，墨水材料必須保持液態(tài),，以便能夠形成液滴并在沉積后立即凝固,，從而形成一個(gè)3D 結(jié)構(gòu)的支架。噴墨打印技術(shù)結(jié)合了數(shù)據(jù)驅(qū)動(dòng)和非接觸方法,，能夠使精確體積的墨水以高速和準(zhǔn)確的方式沉積在目標(biāo)位置,。目前有多種類型的噴墨打印，如基于熱能機(jī)制,、壓電機(jī)制等（圖2a）,。用于生物打印的噴墨技術(shù)已經(jīng)成功地打印了液體生物墨水，在微米尺度分辨率下,，可以同時(shí)沉積不同類型的材料和細(xì)胞并精準(zhǔn)定位,。噴墨生物打印在打印分辨率上具有一定的優(yōu)勢(shì)，已有研究表明,，按需噴墨打印可以用來(lái)精確地沉積細(xì)胞而不犧牲其活力,，對(duì)細(xì)胞的精確定位可以促進(jìn)精細(xì)神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)的建立。噴墨打印技術(shù)的主要問(wèn)題是細(xì)胞或材料可能會(huì)堵塞打印頭的噴嘴,，這可能會(huì)產(chǎn)生熱應(yīng)力,、機(jī)械應(yīng)力等，從而損傷細(xì)胞,。為了防止噴嘴堵塞,，墨水必須具備低粘度和低細(xì)胞密度。這些條件的控制反過(guò)來(lái)又導(dǎo)致打印過(guò)程中的其他限制（如液滴擴(kuò)散,、細(xì)胞沉淀等),。

擠出打印是在計(jì)算機(jī)控制下，通過(guò)可移動(dòng)打印頭上的噴嘴逐層沉積材料實(shí)現(xiàn)的（圖2b),。它分為基于熔融和基于溶液兩種打印方法,。擠出打印技術(shù)是應(yīng)用最廣泛的構(gòu)建載細(xì)胞的3D結(jié)構(gòu)的技術(shù)之一，它使用活塞或螺桿不斷擠出生物墨水,。擠壓產(chǎn)生的壓力和剪切力是造成細(xì)胞損傷的主要原因,，因此需要對(duì)打印參數(shù)（細(xì)胞密度、生物墨水粘度,、溫度,、氣壓等）進(jìn)行優(yōu)化,，以防止細(xì)胞凋亡。這種生物打印方法的最大優(yōu)點(diǎn)是可以打印細(xì)胞密度較高的粘性生物墨水,，這是其他打印技術(shù)不易達(dá)到的,。另一方面，與其他打印方法相比,，擠出生物打印的分辨率稍差,，對(duì)打印形狀和固定細(xì)胞位點(diǎn)的精確預(yù)置能力較低。常用的基礎(chǔ)打印工藝主要包括熔融沉積成型（FDM）,、墨水直寫(xiě)和近場(chǎng)直寫(xiě)（MEW）,。

圖2（a）噴墨打印和（b）擠出打印的示意圖。經(jīng)許可轉(zhuǎn)載,，版權(quán)所有Elsevier Ltd,。

光固化技術(shù)（SLA）是基于液體光敏樹(shù)脂的光聚合原理的工藝，即在紫外或者其他光源照射下液態(tài)光敏樹(shù)脂發(fā)生光聚合反應(yīng)從而固化,。當(dāng)計(jì)算機(jī)控制的激光束在偏轉(zhuǎn)鏡的作用下掃描到樹(shù)脂液體表面時(shí),，光斑經(jīng)過(guò)的區(qū)域液體從點(diǎn)到面凝固。當(dāng)?shù)谝粚訏呙柰瓿珊�,，升降機(jī)驅(qū)動(dòng)平臺(tái)下降一層高度,，然后掃描下一層，直到得到一個(gè)完整的3D實(shí)體,。因此,，SLA是一個(gè)相對(duì)緩慢的打印過(guò)程（圖3a）。使用SLA技術(shù)可以構(gòu)建具有明確定義的微觀結(jié)構(gòu)和互連孔隙的組織工程支架,。與基于噴墨和擠出的打印相比,，SLA不存在噴嘴堵塞的問(wèn)題，因此擴(kuò)大了生物墨水粘度和細(xì)胞密度的范圍,。但細(xì)胞活力將受到SLA工藝要求的顯著影響,，即生物墨水須與光源兼容。此外,，在SLA工藝中,，用于交聯(lián)水凝膠的摻入光引發(fā)劑引起的材料毒性也是該技術(shù)在生物打印中應(yīng)用的主要挑戰(zhàn)之一。因此需要對(duì)生物相容性打印墨水進(jìn)行更多的研究,，以提高SLA在臨床相關(guān)神經(jīng)組織工程結(jié)構(gòu)中的應(yīng)用,。

面投影技術(shù)（DLP）也是基于樹(shù)脂材料的光聚合反應(yīng)，不同于SLA的自下而上,，DLP是一種自上而下的方法,。DLP和SLA工藝的主要區(qū)別在于SLA可以投射激光束的光斑，而在DLP系統(tǒng)中由數(shù)百萬(wàn)面鏡子組成的數(shù)字微鏡裝置（DMD）可以直接將二維的平面圖像投射到光敏材料的平面,，從而大大提高了打印效率（圖3b）,。盡管DLP有很多的優(yōu)勢(shì),，但是適用于神經(jīng)組織工程的打印材料還有待開(kāi)發(fā)。

圖3（a）立體光固化和（b）面投影技術(shù)的示意圖,。經(jīng)許可轉(zhuǎn)載,，版權(quán)所有(2012) Elsevier Ltd。

3.2. 3D打印在周?chē)�神�?jīng)和脊髓損傷修復(fù)中的應(yīng)用
3D打印功能性支架誘導(dǎo)神經(jīng)分化
在使用3D打印技術(shù)構(gòu)建神經(jīng)支架的過(guò)程中,，可以預(yù)先設(shè)計(jì)打印墨水的物理和生物化學(xué)性質(zhì)以及形成的支架結(jié)構(gòu)，以獲得可以引導(dǎo)神經(jīng)分化的功能性支架,�,？紤]到神經(jīng)組織的電生理特性，許多研究使用3D打印技術(shù)來(lái)制備導(dǎo)電支架,。圖4總結(jié)了多種用于誘導(dǎo)神經(jīng)分化的3D打印功能性支架的方法和效果,。

圖4（a–c）用于培養(yǎng)PC12細(xì)胞的導(dǎo)電PPy/膠原基底示意圖，以及噴墨打印的PPy直線和在導(dǎo)電支架上生長(zhǎng)的PC12細(xì)胞的圖像,。經(jīng)許可轉(zhuǎn)載,，版權(quán)所有(2012) Elsevier B.V。（d–f）用于引導(dǎo)神經(jīng)細(xì)胞定向生長(zhǎng)的3D打印功能化納米復(fù)合材料示意圖,，以及分別在純PCL膜和CNF基復(fù)合材料上培養(yǎng)的神經(jīng)細(xì)胞行為的圖像,。經(jīng)許可轉(zhuǎn)載，版權(quán)所有Royal Society of Chemistry,。（g–j）3D導(dǎo)電神經(jīng)支架的示意圖,，以及電刺激作用下3D打印支架中DRG細(xì)胞的行為和功能。經(jīng)許可轉(zhuǎn)載,，版權(quán)所有(2019) Elsevier B.V,。（k–m）光刺激響應(yīng)的3D打印支架示意圖，以及支架多孔結(jié)構(gòu)和NSCs在有/無(wú)光刺激作用下第14天的神經(jīng)元分化圖像,。經(jīng)許可轉(zhuǎn)載,，版權(quán)所有(2017) IOP Publishing Ltd。

3D打印神經(jīng)引導(dǎo)導(dǎo)管用于周?chē)�神�?jīng)修復(fù)
大量研究證明,，神經(jīng)引導(dǎo)導(dǎo)管（NGCs）作為一種組織工程植入物,，在PNI修復(fù)中具有廣闊的應(yīng)用前景。然而,，現(xiàn)有的NGCs存在許多挑戰(zhàn),，如復(fù)雜的制造過(guò)程、簡(jiǎn)單的體系結(jié)構(gòu)以及缺乏有效的指導(dǎo)信號(hào),。作為一種快速成型技術(shù),，3D打印可以輕松快速地構(gòu)建所需的結(jié)構(gòu)，以模擬神經(jīng)組織的宏觀和微觀結(jié)構(gòu),。作者總結(jié)了四類促進(jìn)周?chē)�神�?jīng)修復(fù)和再生的3D打印NGCs,，包括能夠改善微環(huán)境的各向異性NGCs,、增強(qiáng)神經(jīng)再生的藥物遞送NGCs、加速臨床應(yīng)用的個(gè)性化NGCs和輔助神經(jīng)縫合術(shù)的特殊設(shè)計(jì)NGCs,。圖5和圖6分別總結(jié)了3D打印制造各向異性NGCs和個(gè)性化NGCs的方法和效果,。

圖5（a–e）模擬PNI微環(huán)境的3D打印多尺度NGC的示意圖，仿生支架及NGC的結(jié)構(gòu),，以及外周神經(jīng)再生的體外和體內(nèi)研究結(jié)果,。經(jīng)許可轉(zhuǎn)載，版權(quán)所有(2021) Wiley-VCH GmbH,。（f–m）用可見(jiàn)光催化的功能化3D生物活性NGC的示意圖,，3D打印支架和NGC的各向異性結(jié)構(gòu)，以及對(duì)PC12細(xì)胞行為的指導(dǎo)作用,。經(jīng)許可轉(zhuǎn)載,，版權(quán)所有(2020) Elsevier Ltd。

圖6（a–f）DLP打印的具有多通道結(jié)構(gòu)的NGCs以及對(duì)NCSCs分化和功能的影響,。經(jīng)許可轉(zhuǎn)載,，版權(quán)所有(2020) Elsevier Ltd。（g–m）個(gè)性化定制的3D打印NGCs以及坐骨神經(jīng)損傷的體內(nèi)研究,。經(jīng)許可轉(zhuǎn)載,，版權(quán)所有(2018) Elsevier Ltd。

3D打印結(jié)構(gòu)促進(jìn)脊髓神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)建立
細(xì)胞的精確空間排列對(duì)組織的功能性生長(zhǎng)至關(guān)重要,。由于脊髓包含一系列具有各種組織形態(tài)的細(xì)胞類型,，這一點(diǎn)尤為重要。另外,，精確的時(shí)空形態(tài)發(fā)生梯度產(chǎn)生特定的基因表達(dá)模式并控制神經(jīng)前體細(xì)胞（NPCs）的增殖和分化,，是驅(qū)動(dòng)脊髓中具有不同功能的不同細(xì)胞群的原因。3D打印技術(shù)在構(gòu)建具有精確空間組織的多細(xì)胞神經(jīng)組織和具有分子濃度梯度的支架方面具有可行性,，可以促進(jìn)脊髓網(wǎng)絡(luò)的建立,。圖7總結(jié)了3D打印結(jié)構(gòu)促進(jìn)脊髓神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)建立的方法和效果。

圖7（a–i）負(fù)載sNPCs和OPCs的3D打印生物相容性脊髓支架的構(gòu)建以及用于SCI修復(fù)的體外研究,。經(jīng)許可轉(zhuǎn)載,，版權(quán)所有(2018) WILEY-VCH Verlag GmbH & Co. KGaA, Weinheim。（j–n）3D打印支架的示意圖以及脊髓神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)形成的體外研究,。經(jīng)許可轉(zhuǎn)載,，版權(quán)所有Wiley-VCH GmbH。

3D打印脊髓樣支架用于SCI修復(fù)
3D打印為脊髓損傷修復(fù)提供了各種可行的解決方案,，使用不同的生物墨水材料并結(jié)合不同的成分（如細(xì)胞,、生長(zhǎng)因子和生物分子）來(lái)促進(jìn)脊髓再生。可以打印由生物材料,、活細(xì)胞和/或生物活性因子組成的生物墨水,，通過(guò)精確調(diào)節(jié)生物墨水中各成分的比例和打印條件，可以更好地模擬組織或器官的生理結(jié)構(gòu),、機(jī)械性能和生物功能,，最終實(shí)現(xiàn)損傷組織/器官的精確制造和快速修復(fù)。圖8總結(jié)了3D生物打印支架改善干細(xì)胞治療并促進(jìn)SCI修復(fù)的方法和效果,。

圖8（a–f）負(fù)載NSCs的生物打印脊髓樣支架的示意圖,，以及植入12周后SCI修復(fù)的體內(nèi)研究。（d）中的GFP（綠色）和Tuj1（紅色）,、（e）中的GFP（綠色）和NF（紅色）以及（f）中的GFP（綠色）和Oligo2（紅色）的免疫染色分別顯示了病變區(qū)域中植入的神經(jīng)干細(xì)胞的存活和神經(jīng)分化,、成熟神經(jīng)元的形成以及少突膠質(zhì)細(xì)胞的分化。經(jīng)許可轉(zhuǎn)載,，版權(quán)所有(2021) Elsevier Ltd。（g–m）負(fù)載NSCs和OSMI-4的3D打印SM水凝膠支架（SM-OSMI-4 + NSCs）的示意圖,，以及SCI修復(fù)的體外和體內(nèi)研究結(jié)果,。（j）中的活/死染色顯示培養(yǎng)7天后，3D生物打印支架中NSCs的存活情況,。（k）中的GFAP（綠色）和Tuj1（紅色）,、（l）中的NF（紅色）和（m）中的GAP43（紅色）的免疫熒光染色顯示了植入兩個(gè)月后SM-OSMI-4 + NSCs組病變區(qū)域的神經(jīng)絲再生和軸突再生情況。經(jīng)許可轉(zhuǎn)載,，版權(quán)所有(2022) Elsevier Ltd,。

未來(lái)展望
3D打印技術(shù)的快速發(fā)展和持續(xù)創(chuàng)新打破了傳統(tǒng)技術(shù)在制造先進(jìn)神經(jīng)組織工程支架方面的局限性，可以構(gòu)建復(fù)雜的神經(jīng)支架,。然而,，未來(lái)仍面臨一些挑戰(zhàn)：
（1）天然周?chē)�神�?jīng)具有多尺度的層次結(jié)構(gòu)，3D打印支架有望準(zhǔn)確模擬周?chē)�神�?jīng)的結(jié)構(gòu),。但大多數(shù)基于擠出的3D打印支架只能在低水平上模擬分層結(jié)構(gòu),，并且打印分辨率有限。因此,，應(yīng)該開(kāi)發(fā)更復(fù)雜的微擠壓噴嘴,，以實(shí)現(xiàn)具有更高分辨率的神經(jīng)支架的制造，甚至實(shí)現(xiàn)多尺度3D打�,�,；
（2）神經(jīng)元的細(xì)胞體和軸突分別組成天然脊髓的灰質(zhì)和白質(zhì)，呈現(xiàn)出具有多種功能的異質(zhì)結(jié)構(gòu),。然而,，具有各種功能的集成的脊髓支架很難制造。因此，應(yīng)采用優(yōu)化的3D打印策略來(lái)構(gòu)建具有復(fù)雜特征的定制支架,，以實(shí)現(xiàn)多組分3D打�,。�
（3）在長(zhǎng)距離PNI中,，由于缺乏足夠的生化信號(hào)引導(dǎo),，即使引入了NGCs，受傷的神經(jīng)也很難跨越鴻溝再生,。因此,，應(yīng)該開(kāi)發(fā)更卓越的3D打印技術(shù)，通過(guò)在打印過(guò)程中原位結(jié)合所需的生物化學(xué)信號(hào)來(lái)“縮短”神經(jīng)損傷的距離,；
（4）有效的電信號(hào)傳導(dǎo)對(duì)神經(jīng)再生至關(guān)重要,，但目前3D打印支架中使用的導(dǎo)電/壓電材料是不可降解的。因此,，有必要開(kāi)發(fā)新型的,、生物相容的可打印材料；
（5）提供具有足夠血管化的支架以便在神經(jīng)再生過(guò)程中輸送足夠的氧氣和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)是至關(guān)重要的,，但很少有支架是專門(mén)制造用以實(shí)現(xiàn)具有必要血管化的神經(jīng)再生,。因此，為了構(gòu)建神經(jīng)再生增強(qiáng)和血管生成增強(qiáng)的支架,，需要適當(dāng)?shù)牟呗�,，例如血管生長(zhǎng)因子的控制釋放和支架中血管樣通道的建立。圖9總結(jié)了3D打印神經(jīng)支架的挑戰(zhàn)與前景,。

圖9 3D打印神經(jīng)支架的挑戰(zhàn)與前景,。