增加生物墨水異質(zhì)性,，提高3D打印質(zhì)量和細胞活力

來源： EngineeringForLife

生物打印是一種不斷發(fā)展的生物醫(yī)學應(yīng)用的通用技術(shù),。理想的生物墨水具有復雜的微環(huán)境，可以模擬人體組織,，允許良好的打印質(zhì)量,，并提供打印后的高細胞活力。近日,，來自德國卡爾斯魯厄理工學院的Bruna R Maciel及其團隊提出了兩種在1-100μm長度尺度上增強明膠生物墨水的異質(zhì)性,，從而獲得良好的打印質(zhì)量和高細胞活力的策略。利用多粒子跟蹤微流變學對膨脹水凝膠異質(zhì)性進行全面的空間和微觀力學表征,。當將聚（乙烯醇）加入到均勻的明膠凝膠中時,，由于微相分離而形成粘性夾雜物。這一現(xiàn)象導致了復雜3D結(jié)構(gòu)的明顯滑移和良好的打印質(zhì)量,，以及由于減少擠壓過程中的剪切損傷,，人肝細胞癌（HepG2）和正常的人真皮成纖維細胞（NHDF）具有高細胞活力。聚合物/納米粘性團簇的形成降低凝膠斷裂的臨界應(yīng)力,，從而促進擠壓,，進而提高打印質(zhì)量和細胞活力。通過微相分離在生物墨水中靶向引入微異質(zhì)性是一種對具有高細胞活力的復雜結(jié)構(gòu)高分辨率3D打印的有效技術(shù),。

相關(guān)研究內(nèi)容以“Targeted micro-heterogeneity in bioinks allows for 3D printing of complex constructs with improved resolution and cell viability”為題于2023年8月21日發(fā)表在《Biofabrication》,。

圖1 細胞活力改善和生物墨水中微異質(zhì)性引入之間的聯(lián)系示意圖

在擠壓打印過程中，剪切力和細胞損傷之間存在明確關(guān)系,。在擠壓過程中,，保護活細胞免受剪切變形和應(yīng)力的影響，從而提高細胞存活率的策略包括形成塞狀流或減少生物墨水的粘性變形（圖1）,。在本研究中,，限制攜帶材料和活細胞之間的剪切力轉(zhuǎn)移方法包括有針對性地引入生物墨水中的微異質(zhì)性（圖1）。

圖2 微異質(zhì)性特征

從MPT視頻序列中獲得的500張圖像生成的疊加圖像顯示,，純明膠是一種均勻的水凝膠,，示蹤劑顆粒均勻地分散在6G樣品中（圖2A）。通過添加第二種聚合物（PVA）,，出現(xiàn)了離散孔狀夾雜物形式的非均勻微觀結(jié)構(gòu)（圖2B,、C中的白色或綠色區(qū)域）。在白光顯微鏡獲得的圖像中可以觀察到圓形的夾雜體（圖2F,，6G2P樣品）,。檢測到的均方位移（MSDs）與時間無關(guān)，表明所有示蹤劑都嵌入在明膠凝膠提供的彈性基質(zhì)環(huán)境中,，所有成分的局部彈性在10-25Pa范圍內(nèi)（圖2G）,。為了用PVA來表征凝膠的空隙空間，用注射器將示蹤劑顆粒直接注入到內(nèi)含物中（圖2H）,。MSDs隨時間呈線性變化（圖2I）,，表明示蹤粒子在周圍材料中自由擴散,。第二種策略是加入納米硅酸鹽顆粒（Laponite-XLG XR），誘導形成密集排列的微異質(zhì)性（圖2D,、E）,。

圖3 宏觀流變學特征：滑移、剪切誘導的斷裂和彈性

視頻快照顯示,，當壓縮樣品時,，聚合物溶液從凝膠中釋放出來（圖3A）。這種液相也導致樣品在高剪應(yīng)力下脫離平行板的幾何形狀,，顯示了樣品6G4P在旋轉(zhuǎn)流變儀測量過程中明顯的壁面滑移行為（圖3B）,。在純明膠凝膠和明膠/合成鋰皂石復合材料（6G、6G0.2L,、6G0.4L）中沒有觀察到這種明顯的滑移行為,，在壓縮過程中沒有發(fā)生液體溢出（圖3F）。在高剪應(yīng)力下會導致凝膠斷裂（圖3G),。6G,、6G0.2L和6G0.4L凝膠的臨界滑移應(yīng)力值非常相似，τ s約為1000Pa（圖3C）,。在給定的剪應(yīng)力下可以觀察到明顯的滑動行為,，這些凝膠的滑動速度大約比純明膠和混合凝膠高2個數(shù)量級（圖3D）。圖3E所示的凝膠和混合明膠/合成鋰皂石凝膠（樣品6G,、6G0.2L,、6G0.4L）的表觀粘度曲線非常相似，表明合成鋰皂石聚集體不影響凝膠的表觀流動行為,。單軸壓縮試驗顯示,，與純凝膠和PVA樣品相比，合成鋰皂石凝膠的楊氏模量E明顯下降（圖3I）,。本研究中提出的兩種微觀異質(zhì)性形成策略的剪切彈性模量G0均有所增加（圖3J）,。

圖4 擠壓生物打印（EBB）：打印質(zhì)量評價

當打印2D結(jié)構(gòu)時,，所有的凝膠都顯示出原木樁幾何形狀（線寬< 1.5 mm）的高形狀保真度（圖4A-E）,。一小部分粘性液滴或致密的粒子簇顯示出明顯改善、更薄的線質(zhì)量（線寬< 0.6 mm,，圖4F）,。人耳3D模型是一個復雜的物體，形狀呈圓形,，比簡單的網(wǎng)格幾何形狀顯示出更多的細節(jié)（圖4G）,。用樣品6G2P在載玻片上方4mm處成功打印出了約58°的獨立耳螺旋突出部分（圖4H）。所有的打印結(jié)構(gòu)都顯示了高彈性剪切模量提供的機械穩(wěn)定性（圖4I）。

圖5 3D生物打�,。杭毎�活��

圖6 3D生物打�,。杭毎�活��

活/死試驗顯示（圖5A-G），PVA水凝膠在第1天細胞活力高（圖5D）,，而均質(zhì)純明膠水凝膠的活力明顯較低,。用水凝膠復合材料打印，細胞活力大于65%（圖5H-K）,。第1天嵌入HepG2細胞的樣品顯示在粘合玻片上的四層原木樁結(jié)構(gòu)（圖5L）。在樣品6G,、6G2P和6G0.2L中可以看到打印出的交叉區(qū)域的細節(jié)（圖5M-O）,。

以四層原木樁幾何形狀打印水凝膠，并在第1天分析細胞活力,，以評估對3D打印的直接影響（圖6A-C）和細胞培養(yǎng)7天的影響（圖6E-G）,。第1天，6G水凝膠細胞活力小于80%,，而6G2P和6G0.2L凝膠的細胞活力大于85%（圖6D）,。第7天所有凝膠的細胞表現(xiàn)出相似的伸長。NHDF細胞更集中在水凝膠的邊緣,，所有樣品的活力均大于90%,。圖6H中為樣品6G2P打印在粘接玻片上的四層原木樁支架，在第1天嵌入NHDF細胞,。樣品6G2P第1天和第7天的打印的交叉區(qū)域以及絲之間的空隙區(qū)域的細節(jié)如圖6I-L所示,。綜上所述，本研究開發(fā)了兩種不同的具有定制微異質(zhì)性的明膠生物墨水,，可以制造復雜的3D結(jié)構(gòu),，并顯著提高打印質(zhì)量和細胞活力。

在本研究中,，具有微異質(zhì)性的水凝膠允許在沒有支撐材料的室溫下3D打印獨立的復雜結(jié)構(gòu),，并在細胞培養(yǎng)7天后提供較高的NHDF細胞活力。MPT的微觀結(jié)構(gòu)表征可以為活細胞的3D打印提供良好的微環(huán)境條件,。通過誘導明膠網(wǎng)絡(luò)中粘性孔狀內(nèi)含物或聚合物-納米粘性相互作用引起的微異質(zhì)性形成來調(diào)節(jié)微觀結(jié)構(gòu),，對于打印質(zhì)量和支持細胞3D打印的微環(huán)境發(fā)展具有重要意義。引入微異質(zhì)性的概念以一種直接的方式轉(zhuǎn)移到其他水凝膠系統(tǒng)中,，從而刺激進一步的策略發(fā)展,，以提高打印質(zhì)量和細胞活力。

文章來源：https://orcid.org/0000-0001-7837-2582