絲素蛋白水凝膠的凝膠動力學、形成機制、功能化及 3D 生物打印在生物醫(yī)學中的應用

來源：EFL生物3D打印與生物制造

絲素蛋白（SF）源自蠶繭纖維，具有生物相容性、可降解性和可持續(xù)性，其可加工成多種材料形式，在生物醫(yī)學領域有廣泛應用，其中絲素蛋白水凝膠因可通過調控凝膠過程實現(xiàn)結構和性能的定制，在組織工程等領域頗具價值。然而，絲素蛋白水凝膠存在凝膠速度慢和生物惰性等限制其應用的問題。來自迪肯大學的Jing-Liang Li教授、墨爾本大學的David R. Nisbet教授以及Linpeng Fan團隊綜述了絲素蛋白水凝膠的形成、凝膠機制、動態(tài)控制和功能化等研究領域進展，從分子組裝和結晶的角度深入探討了調控絲素蛋白凝膠動力學的策略和機制，還介紹了功能化途徑及3D打印絲素蛋白水凝膠的實際案例以說明這些策略、機制和途徑的具體應用。相關工作以“Gelation Dynamics, Formation Mechanism, Functionalization, and 3D Bioprinting of Silk Fibroin Hydrogel Materials for Biomedical Applications”為題發(fā)表在《ACS Nano》上。

圖 1. 絲素水凝膠形成過程與應用之間的關系。

研究內容
1. 絲纖維和絲素蛋白結構示意圖，通過掃描電鏡觀察、氨基酸序列分析及分子動力學模擬，研究了天然蠶絲纖維及絲素蛋白（SF）的多層次結構。結果表明，蠶絲纖維由兩根包裹絲膠的SF長絲組成，單根長絲由納米原纖束構成；SF分子含重鏈（~391 kDa）、輕鏈（~25 kDa）和糖蛋白（~30 kDa），重鏈中甘氨酸（45.9%）、丙氨酸（30.3%）等形成的重復序列模塊（如GAGAGS、GAGAGY）通過氫鍵驅動β-折疊結晶區(qū)形成，疏水區(qū)模塊（i、ii）與親水區(qū)模塊（iv）的協(xié)同作用決定了分子組裝行為。   

圖2. 絲纖維和絲素蛋白結構示意圖。   

2. 絲素蛋白水凝膠通過分子組裝和結晶過程的形成示意圖，利用時間分辨圓二色光譜（CD）、傅里葉變換紅外光譜（FTIR）及透射電鏡（TEM），研究了SF水凝膠的凝膠化機制。結果表明，凝膠化過程分為“成核-生長-網絡穩(wěn)定”三階段：SF分子先自組裝形成β-折疊晶核，隨后晶核生長為納米纖維并分支形成單域纖維網絡，最終通過氫鍵、疏水作用和靜電作用交聯(lián)成三維凝膠；凝膠動力學受SF濃度（如7.2 wt% SF凝膠時間比0.6 wt%縮短7天）和分子量調控，高濃度或高分子量加速β-折疊聚集。   

圖3. 絲素蛋白水凝膠通過分子組裝和結晶過程的形成示意圖。   

3. 調節(jié)絲素蛋白水凝膠凝膠動力學的方法示意圖，采用溶液化學調控（pH、離子強度、添加劑）、物理刺激（超聲、渦旋）及界面工程，研究了加速SF凝膠化的關鍵策略。結果表明：① pH調節(jié)至等電點（3.8-3.9）時，電荷中和使凝膠時間縮短至數(shù)小時；② 陽離子表面活性劑（如SDS，8-12 mM）通過靜電屏蔽和疏水誘導，將凝膠時間從8天縮短至15-18分鐘；③ 超聲處理（20-30秒）通過破壞分子內氫鍵促進β-折疊形成，使凝膠時間降至分鐘級，但高能量超聲可能損傷細胞；④ 二元溶劑（如正丁醇）通過脫水作用加速分子聚集，10%正丁醇可使凝膠時間縮短至39.6分鐘。   

圖4. 調節(jié)絲素蛋白水凝膠凝膠動力學的方法示意圖。   

4. 絲素蛋白的結構轉變和凝膠化機制示意圖，結合酶催化（辣根過氧化物酶/過氧化氫體系）、光引發(fā)聚合（甲基丙烯酰化SF）及動態(tài)流變學測試，研究了化學交聯(lián)對凝膠動力學和機械性能的影響。結果表明：① 酶催化氧化酪氨酸殘基形成二酪氨酸交聯(lián)，凝膠時間可控制在分鐘級，且交聯(lián)密度影響儲能模量（G'）；② 光引發(fā)交聯(lián)（UV照射365 nm）使甲基丙烯酰化SF在10分鐘內形成穩(wěn)定水凝膠，打印結構（如仿生氣管）的壓縮模量達11.55 MPa；③ 動態(tài)共價交聯(lián)（如 Genipin）結合β-折疊結晶，可同步提升凝膠強度和生物相容性。   

圖5. 絲素蛋白的結構轉變和凝膠化機制示意圖。   

5. 基于絲素蛋白生物墨水可調凝膠過程制備絲綢支架的3D打印系統(tǒng)示意圖，通過數(shù)字光處理（DLP）、擠出式生物打印及原位交聯(lián)技術，研究了SF生物墨水在復雜結構制造中的應用。結果表明：① DLP技術利用甲基丙烯酰化SF光交聯(lián)，可打印分辨率達100 μm的血管網絡和心臟模型，支持軟骨細胞黏附與分化；② 擠出式打印結合鈣離子觸發(fā)交聯(lián)，可制造含梯度孔隙的骨組織工程支架，與生物玻璃復合后促進成骨細胞礦化；③ 原位打印系統(tǒng)（如FRESH技術）通過可逆嵌入懸浮水凝膠，實現(xiàn)低黏度SF墨水（10% w/w）的3D結構成型，細胞存活率超90%。   

圖8. 基于絲素蛋白生物墨水可調凝膠過程制備絲綢支架的3D打印系統(tǒng)示意圖。   

6. 用于生物醫(yī)學應用的絲素蛋白生物墨水3D打印分層結構示意圖，借助細胞共培養(yǎng)、體內植入實驗及免疫熒光染色，研究了3D打印SF支架的生物醫(yī)學性能。結果表明：① 打印的仿生氣管植入兔模型后，軟骨缺損處可見新生組織形成，II型膠原表達顯著增加；② 含RGD肽修飾的SF水凝膠促進血管內皮細胞黏附，體內誘導毛細血管生成；③ 負載抗腫瘤藥物的SF納米顆粒復合水凝膠，可抑制小鼠皮下肝癌腫瘤生長，CD44+ CD133+腫瘤細胞減少60%以上。   

圖9. 用于生物醫(yī)學應用的絲素蛋白生物墨水3D打印分層結構示意圖。

研究結論
本研究聚焦于絲素蛋白水凝膠，全面綜述其形成、凝膠機制、動態(tài)控制及功能化。研究發(fā)現(xiàn)，絲素蛋白的分子結構（如重鏈重復序列和疏水區(qū)）是凝膠化和功能化的基礎，其凝膠過程通過分子組裝和結晶實現(xiàn)，可通過調節(jié)濃度、pH、離子、表面活性劑等加速凝膠動力學。功能化策略包括化學修飾、納米粒子添加和轉基因技術，賦予水凝膠抗菌、促細胞黏附等特性。3D生物打印技術結合動態(tài)凝膠控制，成功制備復雜仿生結構，用于軟骨、骨組織再生等領域。盡管絲素蛋白水凝膠在生物相容性和可調控性上優(yōu)勢顯著，但其批次間分子量差異、規(guī)模化生產及體內安全性仍需進一步研究，未來發(fā)展方向包括智能化功能整合與精準生物制造。

文章來源：
https://doi.org/10.1021/acsnano.4c18568