蘇黎世大學《Science Advances》：利用生物打印軟骨治療小耳癥

來源： EngineeringForLife

小耳癥是一種先天性疾病,，其特征是外耳在胎兒期發(fā)育異常。其嚴重程度從輕微畸形到完全沒有耳廓不等,。據(jù)估計，全世界每 10,000 名兒童中約有 1.46 人患有小耳癥。小耳癥對患兒的社會心理健康有很大的負面影響,，表現(xiàn)為自尊心下降、社交孤立和焦慮增加,。而這些問題往往要到兒童 10 歲時才能得到治療,，這就加劇了這些問題的嚴重性。目前治療小耳癥的金標準是自體肋軟骨重建術,，即從肋骨上獲取肋軟骨,，然后在肋軟骨上雕刻出耳廓。然后將框架植入顱骨皮下,，在第二階段將耳廓抬高,。然而，這是最具挑戰(zhàn)性的整形外科手術之一,，治療曲線非常陡峭,。手術本身還需要采集足量的肋軟骨，因此通常要推遲到兒童 10 歲以后進行,。另外,，也可以使用多孔高密度聚乙烯（pHDPE）植入物來避免采集肋軟骨。這些植入物雖然具有更好的美學效果,，但植入部位的并發(fā)癥發(fā)生率較高,。

來自瑞士蘇黎世大學的Agnes S. Klar團隊開發(fā)了一種組織工程治療方法,，該方法基于生物打印的自體耳軟骨結構（EarCartilage），并結合生物工程人類色素和血管前真皮表皮替代物（EarSkin）,，在免疫功能低下的大鼠身上進行了測試,。本研究證實，EarSkin 的人體工程毛細血管在 1 周內與受體的血管相連,，從而實現(xiàn)了快速的血液灌注和表皮成熟,。生物工程 EarSkin 顯示出分層表皮，其中含有成熟的角質細胞和黑色素細胞,。后者位于表皮基底層,，能有效恢復皮膚顏色。此外,，體內測試表明,，EarCartilage 具有良好的機械穩(wěn)定性，細胞外基質沉積也得到了增強,�,？傊�，EarCartilage 與 EarSkin 的結合是治療小耳畸形的一種新方法,，有望克服現(xiàn)有的局限性,，改善小耳畸形重建的美學效果。相關工作以題為“Combining bioengineered human skin with bioprinted cartilage for ear reconstruction”的文章發(fā)表在2023年10月4日的國際頂級期刊《Science Advances》,。

1. 創(chuàng)新型研究內容
本研究展示了人類色素和血管前化皮膚替代物（EarSkin）與生物打印耳軟骨（EarCartilage）的結合（圖 1）,。據(jù)本研究所知，這是首次報道將兩種組織工程移植物結合起來治療小耳癥患者,。在大鼠皮下模型中,，EarCartilage 被植入肉阜下，作為 EarSkin 覆蓋的顳頂筋膜瓣（TPF）的替代物,，這一過程與標準的小耳癥手術治療非常相似,。這兩種組織的結合為治療小耳癥提供了一種新策略，規(guī)避了現(xiàn)有的局限性,。通過使用生物制造的耳廓移植物,，可以省略肋軟骨的采集；通過用組織工程皮膚覆蓋耳廓,，可以避免框架暴露等并發(fā)癥,，同時改善美學效果。

圖1 EarCartilage 和 EarSkin 的組合示意圖

生物工程 EarSkin 是一種源自人類的真皮表皮移植體,，由 I 型膠原蛋白水凝膠制成,，其中包含血管前真皮層和頂部的色素表皮（圖 2A）。人真皮微血管內皮細胞（HDMECs）與人成纖維細胞在真皮層共培養(yǎng)，形成分支毛細血管,，并在體外培養(yǎng) 2 周內排列成血管叢（圖 2B）,。隨著時間的推移，毛細血管的數(shù)量和長度明顯增加,。細胞角蛋白 19（CK19,；人角質形成細胞）和人黑色素瘤黑（HMB-45；人黑色素形成細胞）標記物的全圖成本染色進一步證實了角質形成細胞和黑色素形成細胞在皮膚替代物上播種 1 周后在表皮層的均勻分布（圖 2C）,。此外,，二乙酸熒光素（FdA）染色證實了角質形成細胞和黑色素細胞的存活率，并在播種 1 周后完全覆蓋了表皮層（圖 2D,，表皮和真皮 FdA 染色對比）,。

圖2 體外開發(fā) EarSkin

由于軟骨組織的 ECM 成分復雜，因此能夠承受巨大的負荷,。為了評估軟骨構建體的成熟度,，本研究對細胞化的對照盤（∅ = 6 毫米，高 = 1 毫米）進行了生物打�,。℉ATG 生物墨水）,，并隨時間評估了其組織成熟度（圖 3A）。與之前的研究相比,，本研究通過將人EarCartilage細胞（hAUR）的濃度提高到每毫升 1,500 萬個,，進一步提高了EarCartilage組織的成熟度，并使構建體成熟長達 17 周,。打印后，76.3 ± 6.6% 的軟骨細胞存活,，21 天后增至 92.3 ± 2.9%（圖 3B 和 C）,。此外，軟骨細胞大量增殖,，二次諧波發(fā)生（SHG）信號增加,，表明膠原等 ECM 成分沉積。軟骨尤其依賴其 ECM 成分來承受重負荷,。因此,，組織學染色顯示培養(yǎng)過程中沙弗寧 O 染色強度增加，表明糖胺聚糖（GAG）沉積量增加（圖 3F）,。同樣,，膠原蛋白 II 的染色強度也增加了，并在整個軟骨盤上顯示出更均勻的分布,。到第 9 周時,，整個構建體中都能檢測到膠原蛋白 I，但到第 17 周時，染色僅限于構建體的外圍（圖 3F）,。培養(yǎng) 9 周后檢測到彈性蛋白開始沉積（圖 3F）,。

圖3 軟骨的體外發(fā)育

為模擬工程皮膚與軟骨的結合，本研究開發(fā)了一種體內大鼠模型,，用于進行治療小耳畸形實驗（圖 4A 和 B）,。第一次實驗使用 20 毫米直徑和 1 毫米高的軟骨盤，成熟 9 周后建立模型,，以確保在植入耳廓移植物之前軟骨,、髓核和皮膚移植物之間有充分接觸。選擇較短的體外成熟期是為了進一步評估軟骨移植物在體內是否會向彈性軟骨方向成熟,。圓盤被植入肉阜下,，肉阜相當于臨床上用于耳部重建的TPF，在肉阜上移植血管前真皮表皮移植體（EarSkin）,。植入后,，每周更換敷料時都會對傷口愈合過程進行控制，并對移植物上皮化區(qū)域進行拍照記錄,。對皮膚成熟情況進行了宏觀檢查（圖 4C 至 I）,，并進行了平面測量（圖 4J）。觀察到 EarSkin 的色素沉著與表皮層黑色素細胞產(chǎn)生的黑色素有關（圖 4H 和 I,，白色虛線）,。此外，與第 0 天移植的原始 EarSkin 相比,，本研究觀察到 EarSkin 在 1 周后（72.60 ± 17.52%,，n = 6）和 4 周后（75.04 ± 27.95%，n = 3）略有收縮（圖 4J）,。

圖4 活體EarSkin和軟骨盤

組織學分析進一步表明,，EarSkin-髓核-軟骨盤在體內 1 周后緊密相連（圖 5A）。在 EarSkin 的真皮層中可以看到用人 CD31 染色的人毛細血管,，其周圍是用人 CD90 染色的成纖維細胞（圖 5C）,。此外，通過大鼠 CD31 觀察到的大鼠毛細血管只存在于肉阜,，這證實軟骨盤（CD44 陽性）仍然是無血管的（圖 5D）,。本研究首先從宏觀上評估了移植 EarSkin 的變黑情況，然后用 HMB-45 對黑色素細胞進行染色,，進一步驗證了這一點,。真皮-表皮交界處基底膜的主要成分--人層粘蛋白-5的成本染色證實了黑色素細胞僅位于表皮基底層（圖 5E 和 F）。此外,，通過對人類細胞角蛋白 10（CK10）進行染色,，評估了表皮的成熟和分層情況,。此外，本研究觀察到 CK19 在體內 1 周（圖 5I）至 4 周（圖 5J）期間在表皮基底層的表達量減少,，這表明 EarSkin 已建立表皮穩(wěn)態(tài),。細胞角蛋白 15 (CK15) 在體內 1 周（圖 5I）和 4 周（圖 5J）這兩個時間點都在 EarSkin 的基底層特異性表達。CK19/CK15 著色模式與在原生皮膚中觀察到的模式相似,。

圖5 EarSkin 和軟骨盤的活體評估

組織學和免疫組織學染色證實了軟骨盤的組織成熟程度（圖 6A）,。本研究觀察到 GAGs、膠原蛋白 II 和膠原蛋白 I 的沉積,，但缺乏彈性蛋白,。此外，軟骨細胞表現(xiàn)出陽性的 ki67 表達,，表明體內 1 周后細胞增殖,。為了測試軟骨椎間盤的機械性能，本研究進行了壓縮和壓痕測試,。體外成熟 9 周后,，壓縮模量從最初的 3.6 ± 0.4 千帕增加到 199.1 ± 66 千帕。在體內,，壓縮模量沒有明顯變化,，1 周后達到 162.7 ± 59.8 千帕，4 周后達到 185.4 ± 13.7 千帕（圖 6B）,。同樣,，赫茲模量（壓痕）也從最初的 9.4 ± 2.9 千帕增加到體外成熟 9 周后的 36.4 ± 18.1 千帕。在體內,，1 周后未觀察到明顯變化（30.1 ± 18.2 kPa）,，但 4 周后觀察到明顯降低（20.4 ± 11.2 kPa）（圖 6C）。與本實驗中進行的為期 9 周的體外培養(yǎng)相比,，對照組圓盤（直徑 = 6 毫米,，高 = 1 毫米；圖 3,，D 和 E）的培養(yǎng)期延長了 17 周,，這些結果突出表明了充分成熟過程的重要性,。

圖6 EarSkin 和EarCartilage盤的活體的手術評價

耳廓（EarCartilage）為肉阜和 EarSkin 提供了接近生理的三維表面,。因此，本研究接下來在體內將 EarCartilage 和 EarSkin 結合在一起,，測試 EarSkin 是否能夠覆蓋 EarCartilage,，而不會在 EarCartilage 和肉阜之間出現(xiàn)空腔或擠出 EarSkin（圖 7A 和 B）。根據(jù)對照盤的體外成熟（圖 3）和軟骨盤的體內成熟結果（圖 4 至圖 6）,，耳廓移植物在植入前已成熟 17 周,。較長的體外成熟期使較大的 EarCartilage 移植物得以在整個過程中成熟。移植后，檢查了傷口愈合過程和 EarSkin 成熟情況,。雖然沒有觀察到愈合過程的不良影響,，但 EarSkin 的平面測量結果顯示，在體內使用 1 周后,，EarSkin 有輕微收縮（82.54 ± 30.83%,，n = 6），與植入軟骨盤頂部的 EarSkin 類似（72.60 ± 17.52%,，n = 6）（圖 7C 至 I）,。血紅素和伊紅（H&E）染色證實了體內 EarCartilage 和 EarSkin 構建物之間的緊密連接（圖 8A）。經(jīng) H&E 染色的切片進一步顯示,，即使對這些移植物進行組織學處理,，EarSkin 也未從肉阜上脫落，肉阜也未從 EarCartilage 上脫落,。此外,，為了準備用于機械測試的樣本，必須用剪刀和手術刀小心翼翼地去除耳皮和肉穗,，因為它們不容易從EarCartilage上脫落,，這進一步證實了這三種組織之間的粘附性。

圖7 活體內的EarSkin和EarCartilage

在體內 1 周后,，自組裝的人毛細血管（CD31）完全出現(xiàn)在由人成纖維細胞（CD90,；圖 8C）劃定的 EarSkin 真皮部分。通過對人 CD31 和大鼠 CD31 進行成本染色,，本研究檢查了自組裝的人毛細血管與預先存在的大鼠血管之間的吻合情況（圖 8E 至 G）,。在 EarSkin 的真皮部分觀察到人鼠混合毛細血管（圖 8G，白色箭頭）,，與尚未連接的人（紅色染色）和大鼠毛細血管共存,。人和大鼠雜交毛細血管的功能性吻合和功能性血液灌注通過人 CD31 陽性毛細血管管腔中存在大鼠紅細胞得到進一步證實（圖 8H）。大鼠 CD31 和人類 CD44（一種透明質酸的細胞表面粘附受體）的成本染色進一步證實,，EarCartilage 仍然是無血管的,，沒有人類毛細血管的入侵。此外,，生物工程 EarSkin 顯示出分化和分層的表皮,，包括在整個基底上層表達人 CK10 的角質細胞和表明表皮層分層和成熟的人 CD44（圖 8I）。人類 HMB-45 染色進一步證實了黑色素細胞完全位于表皮基底層,，這與層粘連蛋白 5 的表達有關（圖 8J）,。

圖8 用EarSkin 和 EarCartilage 對 EarSkin 進行活體評估

植入前，EarCartilage 表現(xiàn)出柔韌的彈性行為,，邊緣的壓縮模量達到 459.67 ± 92.17 kPa,，中心的壓縮模量達到 231.71 ± 108.72 kPa,。在體內使用 1 周和 4 周后，EarCartilage 的形態(tài)主要保持不變,，其壓縮模量雖然在體內使用 1 周后短暫下降,，但在體內使用 4 周后保持穩(wěn)定（圖 9A，邊緣：459 67 ± 92 17 kPa,，中心：231 71 ± 108 72 kPa）：17周后為：459.67 ± 92.17 kPa,，17 + 1周后為：323.9 ± 74.6 kPa，17 + 4周后為：423.2 ± 234.1 kPa,；中心：17周后為：231.71 ± 108.72 kPa,，17 + 1周后為：99.9 ± 23.1 kPa，17 + 4周后為：144.9 ± 83.5 kPa）,。然而,，耳廓結構的赫茲模量仍然明顯較軟（圖 9B，邊緣：17 周后為 73.6 ± 55.6 kPa,，17 + 1 周后為 28.2 ± 9.0 kPa,，17 + 4 周后為 110.7 ± 138.4 kPa；中心：17 周后為 28.9 ± 17.9 kPa,，17 + 1 周后為 20.0 ± 6.8 kPa,，17 + 4 周后為 30.3 ± 20.6 kPa）。組織學和免疫組織學染色證實,，隨著彈性蛋白沉積的開始,，GAGs、膠原蛋白 I 和膠原蛋白 II 也開始存在（圖 9）,。與培養(yǎng) 17 周的軟骨盤相似,，膠原蛋白 I 表明纖維軟骨的形成，而彈性蛋白沉積的開始表明這些構建物開始向EarCartilage轉變,。

圖9 用EarSkin 和 EarCartilage 對 EarCartilage 進行活體評估

2. 總結與展望
本研究表明,，結合兩種組織工程構建物--三維軟骨和皮膚--為小耳畸形患者提供了一種先進的個性化治療方案。軟骨組織工程克服了采集肋軟骨的需要,，因此可以對較小的兒童進行手術,。此外，這種方法還可以在耳廓上精確地覆蓋與對側耳皮膚結構和顏色相匹配的皮膚移植體,，從而改善重建后的美觀效果,。最終，本研究證明了 EarCartilage 在體內保持穩(wěn)定,，EarSkin 與宿主的肉阜血管有效吻合,，從而實現(xiàn)了快速的血液灌注和較高的體內移植率,。不過,，今后還需要在免疫功能健全的大型動物模型中進行進一步的體內臨床前試驗,，以評估擬議模型治療小耳癥患者的可行性。

文章來源：
https://www.science.org/doi/full/10.1126/sciadv.adh1890