生物3D打印進(jìn)展綜述：從打印方法到生物醫(yī)學(xué)應(yīng)用

來(lái)源：EFL生物3D打印與生物制造

在過(guò)去的幾十年中，生物3D打印已被廣泛地應(yīng)用于構(gòu)建如皮膚,、血管,、心臟等諸多組織/器官原型，,，這不僅為器官替換的宏偉目標(biāo)奠定基礎(chǔ),，也可作為體外病理模型服務(wù)于藥物篩選、器官發(fā)育及病變等領(lǐng)域�,？紤]到器官/組織有復(fù)雜的結(jié)構(gòu),，種類繁多的生物3D打印方法被開(kāi)發(fā)出來(lái)用以針對(duì)不同的應(yīng)用場(chǎng)景。如何根據(jù)應(yīng)用需求來(lái)選擇合適的生物打印方法,？本綜述中我們系統(tǒng)地回顧了生物3D打印的發(fā)展,、工藝流程和分類，重點(diǎn)介紹了打印的基本原理和商業(yè)化的生物打印設(shè)備,；對(duì)擠出式,、液滴式和光固化式生物3D打印進(jìn)行了總結(jié)和分類，并對(duì)其應(yīng)用提出了建議,；我們認(rèn)為未來(lái)比較會(huì)廣泛應(yīng)用的三個(gè)生物3D打印技術(shù)是投影式光固化打印,、懸浮支撐打印及同軸打印,；而設(shè)計(jì)生物墨水的要點(diǎn)是在可打印性,、生物相容性和機(jī)械性能三者中找到平衡點(diǎn)。

相關(guān)綜述以題為“Development of 3D Bioprinting: FromPrinting Methods to Biomedical Applications”被Asian Journalof Pharmaceutical Sciences在線刊登,，顧則明博士生為一作,，賀永教授為通訊作者。

我們認(rèn)為：生物3D打印技術(shù)仍有著很大的進(jìn)步空間,。組織/器官的復(fù)雜程度給精確的生物打印帶來(lái)了很大的困難,，為解決這一問(wèn)題，多尺寸,、多材料,、多細(xì)胞的生物打印將成為未來(lái)發(fā)展的重點(diǎn)。與天然組織/器官相比,，生物打印的精度較低,，這是目前生物打印技術(shù)的主要缺點(diǎn)之一。而另一個(gè)常見(jiàn)缺點(diǎn)是大尺寸復(fù)雜結(jié)構(gòu)的打印速度慢,，特別是涉及到多材料交替打印,。此外，作為生物3D打印關(guān)鍵應(yīng)用的體外組織模型不僅在尺寸上需要標(biāo)準(zhǔn)化,，在生物相容性能和力學(xué)性能上也需要標(biāo)準(zhǔn)化,，這就對(duì)生物打印技術(shù)的均勻性和再現(xiàn)性提出了更高的要求。相較于其他打印方法,，投影式光固化生物3D打印技術(shù)在這些方面有著不小的優(yōu)勢(shì),。

生物墨水的開(kāi)發(fā)和應(yīng)用是生物打印技術(shù)的關(guān)鍵。研究開(kāi)發(fā)并穩(wěn)定合成能夠平衡可打印性,、生物相容性和機(jī)械性能這三方面的新型生物墨水是生物3D打印應(yīng)用的基礎(chǔ),。目前的許多研究仍局限于使用有限范圍的生物材料，而大多數(shù)人體組織/器官都有ECM成分的復(fù)雜組合，具有特定的生物學(xué)或力學(xué)影響,，單一的生物墨水不可能建立一個(gè)“合成”的微環(huán)境來(lái)模擬體內(nèi)的實(shí)際情況,，這也使得多材料生物打印日益重要。

血管化是生物打印活體結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ),。與組織工程和再生醫(yī)學(xué)領(lǐng)域面臨的挑戰(zhàn)一樣,，確保打印結(jié)構(gòu)充分的血管化是生物3D打印的關(guān)鍵因素。有效構(gòu)建多尺度的灌注血管網(wǎng)絡(luò),，通過(guò)機(jī)械或化學(xué)刺激促進(jìn)其血管化，是生物制造放大組織的基礎(chǔ),。雖然建立血管網(wǎng)絡(luò)的方法有多種,，但每種方法都有其局限性，如噴墨生物打印和實(shí)驗(yàn)室打印分辨率高,，但難以構(gòu)建復(fù)雜的血管網(wǎng)絡(luò),；基于犧牲材料的生物打印需要一個(gè)復(fù)雜的二次成型過(guò)程；同軸生物打印具有構(gòu)建多尺寸流道的可行性和灌注培養(yǎng)的能力,，在血管化領(lǐng)域有著廣闊的應(yīng)用前景,。

實(shí)現(xiàn)功能化是生物3D打印的首要目標(biāo)。目前的大多數(shù)研究仍集中在打印過(guò)程和機(jī)制,，這是面向制造業(yè)的想法,，而生物3D打印功能化的核心因素是要從基礎(chǔ)研究到實(shí)際應(yīng)用。為實(shí)現(xiàn)功能化,，生物墨水需要具備良好的生物相容性和力學(xué)性能,，以滿足營(yíng)養(yǎng)灌注和植入的要求。同時(shí),，構(gòu)建模擬體內(nèi)微環(huán)境的場(chǎng)景,，包括力學(xué)和化學(xué)刺激，對(duì)打印結(jié)構(gòu)的功能化也至關(guān)重要,。

3D打印就好比切土豆的逆過(guò)程,，切土豆是將土豆加工成土豆片、土豆絲,、土豆丁或土豆泥,，而3D打印則是將土豆片、土豆絲,、土豆丁或土豆泥反向組裝成土豆的過(guò)程,，這四個(gè)過(guò)程就對(duì)應(yīng)了四種典型的3D打印工藝：采用投影光固化組裝的數(shù)字光處理（DLP）、采用纖維堆疊組裝的熔融沉積（FDM）,、采用微球進(jìn)行組裝的噴墨打印以及采用粉末燒結(jié)進(jìn)行組裝的選擇性激光燒結(jié)（SLS）（圖1）,。

而生物3D打印是一門與機(jī)械、材料、生物,、醫(yī)學(xué)等多學(xué)科緊密相關(guān)的前沿技術(shù),。從廣義上來(lái)說(shuō)，直接為生物醫(yī)療領(lǐng)域服務(wù)的3D打印都可視為生物3D打印的范疇,，而從狹義上來(lái)定義,，通常將操縱含細(xì)胞生物墨水構(gòu)造活性結(jié)構(gòu)的過(guò)程稱之為生物3D 打印，此概念也可稱之為細(xì)胞打印,。我們系統(tǒng)總結(jié)了生物3D打印的發(fā)展歷程（圖2）和工藝流程（圖3）,。



圖1 四種切土豆方式對(duì)應(yīng)四種典型3D打印工藝


圖2 生物3D打印回顧


圖3 生物3D打印工藝流程

根據(jù)不同的打印原理和打印材料，我們整理了生物3D打印的分類,，把常見(jiàn)的生物3D打印方法分為了擠出式,、液滴式、光固化式三類,。簡(jiǎn)單來(lái)說(shuō),，擠出式生物打印通過(guò)擠出生物墨水形成連續(xù)纖維來(lái)搭建結(jié)構(gòu)；液滴式生物打印生成離散液滴堆積成型,；光固化生物打印利用光敏材料進(jìn)行光固化并逐層堆疊,，實(shí)現(xiàn)三維模型。擠出式生物打印可根據(jù)不同的出液方式,，分為氣動(dòng)擠出式,、活塞擠出式和螺旋擠出式三種（圖4）。


圖4 擠出式生物打印原理

依據(jù)不同的液滴成形原理,，我們可以把液滴式生物打印分為噴墨式,、電流體動(dòng)力噴射式（EHDJ）和激光輔助式（LAB）等。這其中,，噴墨式生物打印常見(jiàn)的有熱泡式,、壓電式等，而激光輔助式生物打印又可細(xì)分為激光引導(dǎo)直寫(xiě)（LGDW）和激光誘導(dǎo)前移(LIFT)（圖5）,。



圖5液滴式生物打印原理

光固化式生物打印可根據(jù)光掃描的方式不同分為立體光刻（SLA）和數(shù)字光處理（DLP）等,。目前SLA技術(shù)在支架打印中應(yīng)用較多，但在載細(xì)胞打印的應(yīng)用并不多見(jiàn),。而DLP技術(shù)因其有著打印精度高,、速度快、均一性好等優(yōu)點(diǎn)越來(lái)越受到學(xué)術(shù)界的關(guān)注（圖6）,。



圖6 DLP打印原理

我們?cè)敿?xì)描繪了不同生物打印方法在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用,，包括在皮膚、骨/軟骨,、神經(jīng),、肌肉/肌腱,、脂肪、脊髓,、血管/血管化,、類器官、藥物研究/腫瘤模型,、臨床應(yīng)用等方面的研究現(xiàn)狀,，也總結(jié)概述了市場(chǎng)上知名的商業(yè)化生物打印設(shè)備，同時(shí)還對(duì)目前較為火熱的多材料生物打�,。▓D7）和同軸生物打�,。▓D8）進(jìn)行了細(xì)致的闡述。



圖7 多材料生物打印的應(yīng)用


圖8 同軸生物打印的應(yīng)用

各種生物打印方法被發(fā)明出來(lái)用以針對(duì)不同的應(yīng)用場(chǎng)景,，相應(yīng)地,，每種生物打印方法也有著各自的優(yōu)缺點(diǎn)。

擠出式生物打印是目前應(yīng)用最為廣泛的生物打印方法,，其最大的優(yōu)勢(shì)在于可打印的生物相容材料范圍廣泛（包括細(xì)胞團(tuán)、載細(xì)胞水凝膠,、微載體,、脫細(xì)胞基質(zhì)成分等），涵蓋了粘度范圍從30mPa/s 到6×10^7mPa/s的生物材料,，尤其是具有剪切變稀,、快速交聯(lián)特性的水凝膠材料。這意味著能為維持細(xì)胞活力和功能化提供合適微環(huán)境的低粘度材料,，與能為打印結(jié)構(gòu)提供力學(xué)支持的高粘度材料都能與擠出式生物打印很好地結(jié)合,。同時(shí)，擠出式生物打印也有著良好的經(jīng)濟(jì)性和易用性等優(yōu)點(diǎn),，與多材料,、同軸生物打印可緊密結(jié)合。但擠出式生物打印也有著一些缺陷：首先,，其打印精度相對(duì)其他生物打印方式較低,，一般在100μm量級(jí)；其次,，生物墨水的選擇需要兼顧凝膠化,、固化、剪切變稀等性質(zhì),；此外,，由于擠出過(guò)程中不可避免的剪切力可能會(huì)影響細(xì)胞存活率，這在打印細(xì)胞密度較高的生物墨水時(shí)更為明顯,。

噴墨式生物打印有著成本低,、精度高,、速度快等優(yōu)點(diǎn)，也可針對(duì)性地配備多個(gè)噴嘴,，以滿足在同一時(shí)間打印不同的細(xì)胞,、生物材料或生長(zhǎng)因子的需求。然而,，用于噴墨打印的生物墨水粘度要求限制了其適用生物材料的范圍,；由于驅(qū)動(dòng)壓力小，噴墨生物打印無(wú)法打印高粘度材料或高濃度細(xì)胞,，用噴墨技術(shù)實(shí)現(xiàn)生理細(xì)胞密度的生物打印是目前比較困難的,，而低粘度材料會(huì)降低打印成型的結(jié)構(gòu)強(qiáng)度，導(dǎo)致不滿足后續(xù)體外培養(yǎng)和移植的要求,；此外,，噴墨打印過(guò)程中可能會(huì)對(duì)細(xì)胞造成機(jī)械或熱損傷，噴頭也易損耗,，這些缺點(diǎn)限制了噴墨生物打印技術(shù)的廣泛應(yīng)用,。

激光輔助式生物打印相較于前兩者有著一個(gè)先天優(yōu)勢(shì)：其無(wú)噴嘴的打印模式就避免了細(xì)胞/生物材料堵塞噴嘴的問(wèn)題；同時(shí)這也避免了生物墨水與器件的直接接觸,，這種非接觸式制造方法不會(huì)對(duì)細(xì)胞造成機(jī)械損傷,。其打印高粘度生物墨水的生物材料選擇范圍比噴墨打印更廣，打印精度甚至能達(dá)到生成含單個(gè)細(xì)胞的液滴,。但激光輔助生物打印有幾個(gè)明顯的缺點(diǎn)：首先,，成本相對(duì)較高，且缺乏商業(yè)化的打印設(shè)備,，而適合激光生物打印的水凝膠材料并不多,；其次，該方法自動(dòng)化程度不高,，如LIFT原理所述,，每層墨水靠一次次涂層上去，不僅均一性得不到保證,，且費(fèi)時(shí)費(fèi)力,，導(dǎo)致其很難應(yīng)用于復(fù)雜結(jié)構(gòu)打印。

DLP是一種基于面投影的生物3D打印方法,，相比應(yīng)用廣泛的擠出式打印有著更高的打印分辨率和可重復(fù)性,。根據(jù)DLP的成型原理，它在打印速度上有很大的優(yōu)勢(shì),，因?yàn)闊o(wú)論結(jié)構(gòu)多么復(fù)雜,，每一層的打印時(shí)間都不會(huì)增加。此外,，與噴墨生物打印中液滴之間,、或擠出式打印的相鄰纖維之間形成的“邊界”相比,，DLP技術(shù)可以更平滑地堆疊三維結(jié)構(gòu)，從而大大提高了結(jié)構(gòu)的完整性和力學(xué)性能,。在光固化打印工藝中,，未固化的液態(tài)生物墨水可以為打印結(jié)構(gòu)提供良好的支撐，避免打印過(guò)程中水凝膠的坍塌變形,；與LAB相同,，無(wú)噴嘴的打印模式使得噴嘴堵塞、剪切力影響細(xì)胞活性等問(wèn)題不再是困擾,。我們認(rèn)為,，光固化生物打印技術(shù)將在細(xì)胞生物打印技術(shù)中發(fā)揮越來(lái)越重要的作用，有望取代擠出式生物打印成為未來(lái)最為主流的生物3D打印技術(shù),。

而生物墨水的性能大致可從三個(gè)方面予以評(píng)價(jià)：可打印性,、生物相容性和機(jī)械性能（圖9）�,？纱蛴⌒允窃u(píng)估生物墨水的可成型性,，包括可調(diào)節(jié)的生物材料粘度、從溶膠態(tài)到凝膠態(tài)的快速轉(zhuǎn)換性質(zhì),，以及大范圍的可打印參數(shù)等,。生物相容性要求生物墨水盡可能地與人體中細(xì)胞微環(huán)境相似，使細(xì)胞在其中增殖,、擴(kuò)展、分化并交互,。機(jī)械性能要求凝膠態(tài)的生物墨水力學(xué)性能夠強(qiáng),，以支持隨后的培養(yǎng)和植入過(guò)程；生物打印的結(jié)構(gòu)通常需要在體外培養(yǎng),，在此期間常常伴隨著營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的灌注和降解,，需要相當(dāng)?shù)膹?qiáng)度支持；機(jī)械性能不足也會(huì)導(dǎo)致移植失敗,。



圖9 生物墨水性能的評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)

文章來(lái)源：
https://doi.org/10.1016/j.ajps.2019.11.003