生物3D打印在骨骼肌組織工程中的應(yīng)用

來源： EFL生物3D打印與生物制造

骨骼肌組織工程旨在替換或恢復(fù)因疾病,、事故或嚴重手術(shù)而受損或喪失部分功能的骨骼肌,，通過培養(yǎng)從患者體內(nèi)獲得的肌源性祖細胞或干細胞,，直接培養(yǎng)或搭載支架上來制備出可以植入患者體內(nèi)的功能性骨骼肌,。骨骼肌組織工程在再生醫(yī)學(xué)以及基于細胞分析的生物機器人,、生物傳感,、能量收集和藥物篩選方面都有廣泛地應(yīng)用,。但如何利用現(xiàn)有的組織工程制造方法來重現(xiàn)肌肉的復(fù)雜性仍然是一個挑戰(zhàn)。

來自美國加州大學(xué)的Ali Khademhosseini教授團隊在Small雜志上發(fā)表了題目為“3D Bioprinting in Skeletal Muscle Tissue Engineering ”的綜述文章,，簡述了骨骼肌的解剖結(jié)構(gòu)并從打印工藝,、墨水配方及性能、生物3D打印技術(shù)在表面貼裝技術(shù)方面取得的進展等角度概述了生物3D打印技術(shù)在骨骼肌組織工程中的應(yīng)用,。

人體共有600多塊不同的骨骼肌,，約占全身重量的45%，共同參與骨骼支持,，維持各類運動的穩(wěn)定性和協(xié)調(diào)性,，以及新陳代謝的調(diào)節(jié),。骨骼肌解剖學(xué)結(jié)構(gòu)如圖1所示，骨骼肌是由具有收縮能力的肌細胞或肌纖維所組成,，薄層結(jié)締組織包裹的肌肉纖維軸向排列形成一束,，外側(cè)由結(jié)締組織所覆蓋和接合在一起。骨骼肌還與接收營養(yǎng)和清除廢物的血管網(wǎng)相連,，與激活和收縮的神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)相連,，并通過肌腱與骨骼相連。

圖1 骨骼肌解剖學(xué)結(jié)構(gòu)

研究現(xiàn)狀 為了改善骨骼肌細胞分化并獲得具有高功能性的肌肉組織,，目前已經(jīng)開發(fā)了具有特定形貌特征,、硬度、導(dǎo)電性,、聚合物成分和可溶性因子的支架,。此外，通過使用骨骼肌細胞與成纖維細胞的共培養(yǎng)物來工程化肌腱連接,，或與內(nèi)皮細胞共培養(yǎng)來獲得血管化肌肉,。為了進一步改善工程肌肉的功能，研究人員致力于模擬體內(nèi)骨骼肌的結(jié)構(gòu)和微環(huán)境,。所有傳統(tǒng)方法的一個共同點是制造各向異性支架,，以允許肌肉細胞排列和促進肌肉生成。然而,，這些方法在誘導(dǎo)精確的3D空間細胞組織方面有局限性,。如圖2所示，3D 生物打印技術(shù)旨在通過在細胞和基質(zhì)沉積中提供高精度來克服這些限制,，從而快速制造復(fù)雜結(jié)構(gòu)或與神經(jīng)細胞一起獲得神經(jīng)肌肉連接,，來制造更復(fù)雜的工程化組織。

圖2 常規(guī)方法和生物3D打印方法所制備的骨骼肌組織,。a. 3D打印肌腱鏈接,。b.利用靜電紡絲工藝進行肌腱剛度調(diào)節(jié)。c.設(shè)計芯片控制神經(jīng)與肌肉的連接,。d.在3D打印的水凝膠結(jié)構(gòu)上共培養(yǎng)肌肉和運動神經(jīng)元,。

生物3D打印沉積策略 生物3D打印是指可用于制造包含細胞和材料的3D物理結(jié)構(gòu)的技術(shù)。如圖3所示,，常用技術(shù)包括擠出打印,、噴墨打印、激光輔助打印和立體平面打印,。噴墨打印基于一滴一滴的生物墨水沉積,，并使用不同的操作機制，如熱、壓電,、靜電,、聲學(xué)、流體動力學(xué)和微型閥來產(chǎn)生生物墨水液滴,。擠出打印依賴于使用氣動或機械壓力推動生物墨水通過噴嘴,。生物墨水沉積，通過在平臺上沿X-Y方向光柵掃描打印頭而發(fā)生,，打印頭或載物臺沿 Z 方向移動,，允許逐層放置。在激光輔助打印中,，玻璃或石英帶被一薄層金屬覆蓋,，然后裝載生物墨水。激光脈沖誘導(dǎo)金屬膜蒸發(fā),，形成高壓氣泡,，將生物墨水液滴推向基底。在立體平面打印中,，激光以逐點方式固化光敏樹脂,，形成 3D 結(jié)構(gòu)�,；�于投影式光固化��3D打印(DLP)使用數(shù)字微鏡陣列器件,，該器件由數(shù)百萬個可單獨尋址的微鏡組成，這些微鏡可以打開或關(guān)閉,，以逐層的方式固化目標投影3D結(jié)構(gòu)的整個平面,。DLP為使用微米分辨率打印3D結(jié)構(gòu)提供了卓越的速度、分辨率,、可擴展性和靈活性,。

圖3 三種主要的生物3D打印策略

生物墨水配方 天然和合成的聚合物已被廣泛應(yīng)用于生物3D打印骨骼肌的墨水配方。在天然聚合物中,，快速交聯(lián)水凝膠如藻酸鈣或纖維蛋白已經(jīng)直接用作生物墨水或在打印過程中用作支撐材料,，以保持不太穩(wěn)定的生物材料的可打印性。其他天然水凝膠,，如藻酸鹽,、膠原和明膠，已被廣泛用于為工程化組織提供物理支持和細胞支持功能,。此外，通過負載富含自體生長因子的血小板血漿的藻酸鹽生物來制備組織工程支架可增強血管生成,、減少炎癥,、干細胞募集以及心血管和骨骼肌組織再生。如圖4所示，近15年來,，為了精確調(diào)節(jié)天然聚合物的機械性能,，研究人員已經(jīng)開發(fā)出各種化學(xué)官能團如甲基丙烯酰基與天然聚合物共軛,，使它們可通過自由基聚合發(fā)生光交聯(lián),。GelMA、HAMA,、PEGDA,、SilMA、AlgMA,、DexMA,、CSMA等可快速光交聯(lián)的水凝膠材料通過各種混合配方可獲得優(yōu)異的生物學(xué)性能，可以打印出具有不同形狀,、濃度和機械性能的載細胞水凝膠構(gòu)建體,。此外，營養(yǎng)物質(zhì)向細胞的傳遞是大尺度組織制造和維持中的關(guān)鍵問題,，目前研究人員已經(jīng)做了大量工作來促進肌肉組織中的血管化網(wǎng)絡(luò),。例如，使用同軸噴嘴來制造中空結(jié)構(gòu),，通過在復(fù)合 GeLMA(3.5-5%)-藻酸鹽(4%)生物墨水打印內(nèi)皮細胞和新生心肌細胞而獲得血管化的心臟組織,。此外，包括肝,、心臟,、軟骨、皮膚,、脈管系統(tǒng),、腦、肺,、腎,、骨、脊髓,、結(jié)腸,、臍帶、胰腺,、脂肪組織和骨骼肌來源的dECM的生物墨水也被廣泛應(yīng)用于構(gòu)建功能化復(fù)合生物墨水,。

圖4 近15年來已發(fā)表的論文中，生物3D打印骨骼肌所用材料的百分比

生物3D打印在骨骼肌組織工程中的應(yīng)用 生物3D打印能夠?qū)崿F(xiàn)細胞的精確定位和排列,。例如,，將小鼠成肌細胞(C2C12)精確地分布在懸浮的水凝膠基質(zhì)中并可功能化形成具有生理反應(yīng)的肌管,。如圖5a所示，Bashir 和他的同事通過3D打印技術(shù)制造了一種生物裝置,，由兩個不同長度的剛性柱子通過柔性梁連接而成,。溶液中的 C2C12、細胞外基質(zhì)蛋白和基質(zhì)凝膠被澆鑄在柱子周圍和柱子之間并凝膠化剝離,，凝膠的壓實和兩個支柱之間誘導(dǎo)的張力有利于肌管的成熟,，在電脈沖刺激下肌管可發(fā)生收縮使該結(jié)構(gòu)進行類似尺蠖的爬行運動。如圖5b所示,，由一對對抗的骨骼肌組織驅(qū)動的生物混合機器人是由3D打印的樹脂骨架組成,，承載用于主動刺激負載成肌細胞的水凝膠片的電極，該水凝膠片安裝在骨骼的兩側(cè)以充當拮抗肌,。該生物混合機器人能夠進行關(guān)節(jié)旋轉(zhuǎn)角度接近 90°的移動,，可以用來執(zhí)行簡單的動作。

圖5 組織工程機器人,。a. 3D打印水凝膠基質(zhì)的“生物機器人”,，具有不對稱的物理設(shè)計，可由組織工程培養(yǎng)的哺乳動物骨骼肌條驅(qū)動,。b.由一對對抗性骨骼肌組織驅(qū)動的生物工程機器人,。

增材制造在骨骼肌組織功能化構(gòu)建上的優(yōu)勢 如圖6所示，靜電紡絲技術(shù)可制造出有序或無序的聚己內(nèi)酯微纖維束,，用膠原涂覆微纖維可模擬天然肌肉,，可進一步在其表面用2%膠原-2%聚環(huán)氧乙烷(PEO)生物打印 C2C12。與無序的纖維支架相比,，在膠原包被的有序纖維和有序纖維支架上可以觀察到更高的肌節(jié)組織和分化,。在另一項關(guān)于眼內(nèi)壓的研究中，使用由明膠,、纖維蛋白原,、透明質(zhì)酸和甘油組成的生物墨水負載C2C12 進行打印，可觀察到打印后 97%的細胞活力,，細胞排列有序,，且在分化培養(yǎng)基中 7 天后可形成肌管，將構(gòu)建物皮下植入裸鼠體內(nèi),，將解剖的腓總神經(jīng)插入構(gòu)建物中,，可觀察到構(gòu)建體中的神經(jīng)整合，在肌纖維和神經(jīng)接觸上存在乙酰膽堿受體簇,。此外,，構(gòu)建體的血管化是通過內(nèi)皮細胞標記物的表達來誘導(dǎo)的，而肌電圖顯示工程肌肉對電刺激有反應(yīng),，并且仍然是未成熟的,。此外,，微流控技術(shù)與生物3D 打印技術(shù)相結(jié)合，使骨骼肌組織工程可以實現(xiàn)更復(fù)雜結(jié)構(gòu)的制造,。例如，利用微流控打印頭精確劃分兩種不同的光固化墨水,，兩種墨水分別與 C2C12 和 BALB/3T3 成纖維細胞復(fù)合,，再進行復(fù)雜結(jié)構(gòu)打印，可實現(xiàn)兩種細胞類型區(qū)室化生長,，連續(xù)培養(yǎng)可形成排列整齊的多核全條紋肌管,，將構(gòu)建體植入小鼠皮下，分析可獲得緊密排布的的完全成熟的全條紋肌管,。

圖6 骨骼肌組織工程中的增材制造,。a. 模擬骨骼肌分級組織的混合微纖維化聚己內(nèi)酯/膠原支架的制造工藝和光學(xué)/掃描電子顯微鏡圖像。b. 3D打印脫細胞支架,，以促進成肌細胞分化,。c.仿生組織構(gòu)造。肌肉前體被包裹在由PCL柱支撐的水凝膠纖維內(nèi),。d.微流控精確制造含有成肌細胞和成纖維細胞的異質(zhì)性水凝膠纖維,。

綜上所述，生物3D 打印技術(shù)在組織工程,、再生醫(yī)學(xué)和藥物開發(fā)方面具有巨大的潛力,。該技術(shù)有助于克服移植器官的短缺，為構(gòu)建健康或患病的組織模型提供了重要的工程化方法,。

文章來源：https://onlinelibrary.wiley.com/doi/abs/10.1002/smll.201805530