增材制造構(gòu)建可生物降解的金屬支架用于糖尿病頜面骨再生

來源： EngineeringForLife

創(chuàng)傷和疾病引起的頜面骨缺損可導(dǎo)致生理功能障礙（咀嚼,、言語和呼吸）以及心理傷害。由于人口老齡化和城市生活相關(guān)的不健康飲食,，與糖尿�,。―M）相關(guān)的頜面骨缺損的患病率持續(xù)上升。由于咬合負(fù)荷和高血糖微環(huán)境,，糖尿病相關(guān)頜面骨缺損的再生仍然具有挑戰(zhàn)性,。

針對此問題，來自華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院口腔醫(yī)學(xué)院的陳莉莉/華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬協(xié)和醫(yī)院口腔科的許智/趙丹雷提出了一種材料結(jié)構(gòu)驅(qū)動(dòng)的策略,，通過增材制造可降解的Zn-Mg-Cu梯度支架,。Mg和Cu的原位合金化賦予Zn合金良好的抗壓強(qiáng)度以提供機(jī)械支撐，并具有均勻的降解模式以防止局部破裂,。該支架在模擬的高血糖微環(huán)境中表現(xiàn)出良好的抗菌,、血管生成和成骨調(diào)節(jié)能力。

相關(guān)研究成果以“Additive manufacturing of degradable metallic scaffolds for material-structure-driven diabetic maxillofacial bone regeneration”為題于2024年6月29日發(fā)表在《Bioactive Materials》上,。  

方案1 用于材料結(jié)構(gòu)驅(qū)動(dòng)的糖尿病頜面骨再生的Zn-Mg-Cu梯度支架示意圖

1.鋅合金梯度螺旋支架的表征
為了實(shí)現(xiàn)材料結(jié)構(gòu)驅(qū)動(dòng)的骨再生,，作者利用激光增材制造(AM)技術(shù)制造了可降解鋅合金梯度螺旋支架。首先檢查了鋅合金支架的可打印性,、微觀結(jié)構(gòu)特征和力學(xué)行為（圖1）,。梯度螺旋支架由具有良好且致密的表面過渡的鋅合金粉末制備而成，可產(chǎn)生雙曲面和梯度拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)（80%–60%的孔隙率）,。微觀結(jié)構(gòu)分析表明,，細(xì)小的細(xì)胞和柱狀亞結(jié)構(gòu)隨機(jī)分布在鋅合金中，而鋅中的板條晶粒則細(xì)長而粗大,。

為了理解合金元素和AM技術(shù)引起的強(qiáng)化機(jī)制,，作者對Zn-Mg-Cu合金進(jìn)行了TEM觀察。明場圖像顯示存在細(xì)胞晶粒,、位錯(cuò)堆積和沉淀,，表明晶界和位錯(cuò)強(qiáng)化（圖1F）。此外,，Zn-Mg-Cu的HRTEM圖像顯示4H型長周期堆疊有序(LPSO)結(jié)構(gòu)（圖1J）,。根據(jù)高角度環(huán)形暗場(HAADF)圖像，Mg和Cu元素交織并均勻分布在整個(gè)Zn基體中,，表明固溶體強(qiáng)化,。該映射進(jìn)一步表明，AM技術(shù)能夠強(qiáng)化元素在Zn基體中的溶解,，從而減輕元素偏析,。   

圖1 鋅合金梯度螺旋支架的表征

2.降解和電化學(xué)行為
作者進(jìn)一步評估了鋅合金梯度螺旋支架的降解行為。降解28天后,，鋅合金支架表面可見白色降解產(chǎn)物,。所有支架均未觀察到明顯的部分失效,，且與鋅鎂支架相比，鋅-鎂-銅支架的降解產(chǎn)物生成更均勻（圖2A）,。SEM 觀察表明,，Zn-Mg-Cu支架表面自發(fā)形成了微小的球形顆粒。降解的Zn-Mg-Cu支架的EDS映射表明,，支架上形成的白色化合物含有Zn,、Ca,、O,、P和Cl元素（圖2B）。仿生磷酸鈣(CaP)化合物具有生物相容性和骨傳導(dǎo)性,，可以增強(qiáng)血管生成和骨形成,。

此外，作者還構(gòu)建了計(jì)算流體力學(xué)（CFD）模型來分析梯度螺旋結(jié)構(gòu)的傳質(zhì)行為,。通過CFD模擬計(jì)算得出了滲透率和壓降,，如速度和壓力云圖（圖2C）所示。模型表現(xiàn)出不規(guī)則的速度分布,，孔隙中心的速度最高,。大多數(shù)區(qū)域的流速較低（<1.5 mm/s），為細(xì)胞粘附和增強(qiáng)氧氣運(yùn)輸提供了合適的環(huán)境,。為分析合金元素引起的劣化模式差異,，采用動(dòng)電位極化（PDP）和電化學(xué)阻抗譜（EIS）測試方法評估了鋅合金的電化學(xué)腐蝕特性。與鋅相比,，鋅合金的腐蝕電位向負(fù)方向移動(dòng)（圖2D）,。奈奎斯特圖（圖2E）表明，鋅-鎂合金在低頻下比鋅具有更大的阻抗環(huán),，表明腐蝕趨勢增加,。

圖2 鋅合金的體外抗菌及生物相容性性能

3.抗菌特性及生物相容性表征
在頜面部，由于解剖部位的開放性,，骨植入物往往面臨更復(fù)雜的微生物學(xué)挑戰(zhàn),，這可能導(dǎo)致更高的骨再生失敗風(fēng)險(xiǎn)。因此,，Zn合金植入物已被設(shè)計(jì)成具有增強(qiáng)的抗菌性能,，以有效管理微生物并成功重建缺損。作者以革蘭氏陽性金黃色葡萄球菌(S. aureus)和革蘭氏陰性大腸桿菌(E. coli)評估了Zn合金的抗菌活性,。將各種Zn合金與細(xì)菌共培養(yǎng),，并使用SEM觀察其形態(tài)。結(jié)果發(fā)現(xiàn),，當(dāng)與Zn-Mg-Cu組一起培養(yǎng)時(shí),，金黃色葡萄球菌和大腸桿菌均表現(xiàn)出顯著的收縮和損傷（圖3A）,。此外，使用平板涂布法進(jìn)行了細(xì)菌粘附試驗(yàn),，對照組瓊脂平板幾乎完全被金黃色葡萄球菌和大腸桿菌菌落覆蓋,，而鋅合金上的菌落數(shù)量明顯較少，鋅-鎂-銅合金上僅觀察到少量菌落（圖3B）,。鋅-鎂-銅組的抑菌率顯著提高,，達(dá)到純鋅的4.5倍和鋅-鎂組的2.6倍（圖3C）。這些結(jié)果證實(shí)了鋅-鎂-銅組對控制細(xì)菌感染是優(yōu)異成效,。   

成骨細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞在骨再生過程中起著至關(guān)重要的作用,，對于確定植入物的生物相容性至關(guān)重要。在本研究中,，成骨細(xì)胞前體細(xì)胞系MC3T3-E1和內(nèi)皮細(xì)胞系HUVEC用于評估鋅合金植入物的體外生物相容性,。將MC3T3和HUVEC細(xì)胞與濃度為25%的各種鋅合金提取物共培養(yǎng)以評估材料對細(xì)胞增殖的影響。鋅-鎂-銅組表現(xiàn)出最明顯的增殖增強(qiáng)潛力（圖3D）,。此外,，使用活/死染色評估了不同鋅合金對MC3T3和HUVEC細(xì)胞的細(xì)胞毒性。孵育24小時(shí)后,，所有組中幾乎沒有死細(xì)胞被染成紅色,，這表明鋅合金植入物表現(xiàn)出良好的生物相容性，沒有任何明顯的細(xì)胞毒性作用（圖3E）,。

圖3 抗菌性能和生物相容性的探究

4.模擬高血糖微環(huán)境中的體外血管生成潛力
骨再生過程與血管生成過程密切相關(guān),。作為一種全身代謝性疾病，糖尿病常常伴有多種血管功能障礙,。在高糖杜氏改良的Eagle培養(yǎng)基中培養(yǎng)的HUVEC細(xì)胞用于體外評估鋅合金在高血糖微環(huán)境中的血管生成性能,。免疫熒光染色顯示，高糖環(huán)境中的HUVEC細(xì)胞擴(kuò)散不良,，細(xì)胞擴(kuò)散面積減少,。但所有鋅合金組中高糖引起的細(xì)胞收縮都得到部分緩解，表明細(xì)胞活力提高（圖4A）,�,；�于此進(jìn)行了細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)，以評估不同鋅合金提取物對HUVEC的體外遷移能力,，如圖4B所示,，與高糖組相比，在用鋅合金提取物孵育24小時(shí)后,，劃痕寬度明顯減小,。Zn-Mg-Cu組的愈合率達(dá)到80%，幾乎與正常組相當(dāng)，這凸顯了其在促進(jìn)HUVEC遷移方面的有效性（圖4D）,。   

作者進(jìn)一步使用小管形成試驗(yàn)評估了鋅合金誘導(dǎo)血管生成的潛力,。如圖4C所示，高葡萄糖阻礙了HUVEC細(xì)胞中的小管形成,，導(dǎo)致與對照組相比,，小管脆弱且不完整。施用Zn-Mg-Cu提取物后,，觀察到更多具有良好形態(tài)特征的毛細(xì)血管網(wǎng)絡(luò)（圖4C）,。定量分析顯示，相應(yīng)的網(wǎng)格,、節(jié)點(diǎn)和總長度高于其他治療組,，表明Zn-Mg-Cu組具有促進(jìn)血管形成的調(diào)節(jié)能力（圖4E）。此外,，Zn-Mg-Cu組顯著減輕了高葡萄糖環(huán)境對HUVEC中VEGF蛋白表達(dá)（圖4F-G）的抑制作用,。總之,，Zn-Mg-Cu組增強(qiáng)了HUVEC在模擬高血糖微環(huán)境中的血管生成能力，為長期骨再生創(chuàng)造了有利的環(huán)境   

圖4 模擬高血糖微環(huán)境中鋅合金的體外血管生成潛力

5.模擬高血糖微環(huán)境中成骨細(xì)胞的體外成骨分化
接下來,，作者使用高糖培養(yǎng)基DMEM研究了鋅合金對模擬高血糖微環(huán)境中MC3T3-E1細(xì)胞成骨分化的影響,。通過ALP染色評估細(xì)胞的功能狀態(tài)，高糖(HG)組在任何時(shí)間點(diǎn)均無明顯的ALP陽性染色,。14天后,，Zn-Mg-Cu組的ALP活性超過Zn-Mg合金組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,，茜素紅染色進(jìn)一步支持了這一結(jié)果（圖5A）,。為了進(jìn)一步在分子生物學(xué)水平上評估鋅合金的成骨作用，進(jìn)行了成骨相關(guān)基因的qRT-PCR檢測,。與單獨(dú)使用相比,，當(dāng)鋅、鎂和銅協(xié)同作用時(shí),，成骨分化能力顯著增強(qiáng),。此外，免疫熒光染色顯示,，在用Zn-Mg-Cu提取物培養(yǎng)的MC3T3細(xì)胞中,，骨鈣素（最豐富的成骨細(xì)胞特異性蛋白，與骨形成的葡萄糖代謝有關(guān)有所增加（圖5D）,。此外,，還進(jìn)行了蛋白質(zhì)印跡分析，以評估模擬高血糖微環(huán)境中第14天MC3T3細(xì)胞的成骨分化能力。Zn-Mg-Cu在成骨相關(guān)蛋白（RUNX2和OCN）方面表現(xiàn)出更高的產(chǎn)量,。這些結(jié)果表明,，Zn-Mg-Cu對促進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)礦化和鈣沉積的顯著作用可能是通過調(diào)節(jié)模擬高血糖微環(huán)境中成骨細(xì)胞的葡萄糖代謝來實(shí)現(xiàn)的。   

圖5 模擬高血糖微環(huán)境中鋅合金植入物誘導(dǎo)的體外成骨分化

6.鋅合金支架誘導(dǎo)糖尿病兔下頜骨缺損骨再生的體內(nèi)評價(jià)   
最后,，作者進(jìn)行了植入實(shí)驗(yàn)以測試不同鋅合金支架在糖尿病條件下的生物安全性和促成骨作用,，建立了糖尿病兔下頜骨缺損模型。糖尿病兔在術(shù)后4和12周被人道處死,，并切取下頜骨進(jìn)行進(jìn)一步分析,。進(jìn)行Micro-CT掃描以觀察下頜骨缺損的新骨形成結(jié)果。下頜骨缺損的3D重建和冠狀圖像顯示新骨滲透并生長到鋅合金支架的多孔結(jié)構(gòu)中,，而未植入的糖尿病組則觀察到明顯的骨凹陷（圖6A）,。根據(jù)定量顯微CT分析和重建圖像，植入后4周,，Zn-Mg和Zn-Mg-Cu支架周圍的新骨明顯比Zn植入物更廣泛,。利用Micro-CT評估了Zn-Mg-Cu植入物的體內(nèi)降解行為。植入后4周和12周,，Zn合金支架未發(fā)生明顯斷裂,。因此，Zn合金支架能夠保持機(jī)械完整性并防止骨愈合過程中的早期機(jī)械故障,。

為了進(jìn)一步定位新骨形成的部位,，進(jìn)行了鈣黃綠素?zé)晒鈽?biāo)記。組織學(xué)和熒光顯微鏡照片顯示,，礦化物可以沿著植入物的曲面不斷沉積和生長,，植入12周后可以在Zn-Mg-Cu支架周圍觀察到更多結(jié)構(gòu)良好的新骨，而對照組則出現(xiàn)彌漫性礦化和炎癥組織（圖6C-D）,。與鈣黃綠素染色結(jié)果一致,，Van Gieson染色顯示在4周和12周時(shí)材料-組織界面處形成了染成鮮紅色的膠原纖維，并長入Zn-Mg-Cu的梯度孔隙中（圖6E）,�,？傮w而言，通過摻入Mg和Cu元素以及梯度結(jié)構(gòu)構(gòu)建,，Zn-Mg-Cu支架有可能在高血糖微環(huán)境下提供更積極的愈合過程和更快的骨再生,。   

圖6 體內(nèi)評估鋅合金支架在糖尿病兔下頜骨缺損中誘導(dǎo)骨再生的作用

綜上，本文通過增材制造可降解的Zn-Mg-Cu梯度支架,，開發(fā)了一種材料結(jié)構(gòu)驅(qū)動(dòng)的糖尿病頜面骨再生策略,。通過邊界工程策略對Mg和Cu進(jìn)行原位合金化，支架表現(xiàn)出良好的機(jī)械強(qiáng)度和均勻的降解模式,。雙金屬離子的同時(shí)釋放促進(jìn)了模擬高血糖微環(huán)境中細(xì)菌的消除和成骨細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞的增殖,，從而在體外表現(xiàn)出良好的成骨和血管生成能力。此外，梯度結(jié)構(gòu)的仿生拓?fù)浜瓦m當(dāng)?shù)臐B透性增強(qiáng)了骨愈合過程中的骨傳導(dǎo)性,，從而改善了糖尿病兔下頜骨缺損模型中新骨的生長和形成,。總的來說,，該工作為梯度Zn-Mg-Cu支架在治療糖尿病頜面骨缺損中的臨床應(yīng)用潛力指明了方向,。   

文章來源：
https://doi.org/10.1016/j.bioactmat.2024.06.028