增材制造構(gòu)建可生物降解的金屬支架用于糖尿病頜面骨再生

來源： EngineeringForLife

創(chuàng)傷和疾病引起的頜面骨缺損可導(dǎo)致生理功能障礙（咀嚼,、言語和呼吸）以及心理傷害,。由于人口老齡化和城市生活相關(guān)的不健康飲食，與糖尿�,。―M）相關(guān)的頜面骨缺損的患病率持續(xù)上升,。由于咬合負(fù)荷和高血糖微環(huán)境，糖尿病相關(guān)頜面骨缺損的再生仍然具有挑戰(zhàn)性,。

針對(duì)此問題,，來自華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院口腔醫(yī)學(xué)院的陳莉莉/華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬協(xié)和醫(yī)院口腔科的許智/趙丹雷提出了一種材料結(jié)構(gòu)驅(qū)動(dòng)的策略，通過增材制造可降解的Zn-Mg-Cu梯度支架,。Mg和Cu的原位合金化賦予Zn合金良好的抗壓強(qiáng)度以提供機(jī)械支撐,，并具有均勻的降解模式以防止局部破裂。該支架在模擬的高血糖微環(huán)境中表現(xiàn)出良好的抗菌,、血管生成和成骨調(diào)節(jié)能力,。

相關(guān)研究成果以“Additive manufacturing of degradable metallic scaffolds for material-structure-driven diabetic maxillofacial bone regeneration”為題于2024年6月29日發(fā)表在《Bioactive Materials》上。  

方案1 用于材料結(jié)構(gòu)驅(qū)動(dòng)的糖尿病頜面骨再生的Zn-Mg-Cu梯度支架示意圖

1.鋅合金梯度螺旋支架的表征
為了實(shí)現(xiàn)材料結(jié)構(gòu)驅(qū)動(dòng)的骨再生,，作者利用激光增材制造(AM)技術(shù)制造了可降解鋅合金梯度螺旋支架,。首先檢查了鋅合金支架的可打印性、微觀結(jié)構(gòu)特征和力學(xué)行為（圖1）,。梯度螺旋支架由具有良好且致密的表面過渡的鋅合金粉末制備而成,，可產(chǎn)生雙曲面和梯度拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)（80%–60%的孔隙率）。微觀結(jié)構(gòu)分析表明,，細(xì)小的細(xì)胞和柱狀亞結(jié)構(gòu)隨機(jī)分布在鋅合金中,，而鋅中的板條晶粒則細(xì)長而粗大。

為了理解合金元素和AM技術(shù)引起的強(qiáng)化機(jī)制,，作者對(duì)Zn-Mg-Cu合金進(jìn)行了TEM觀察,。明場圖像顯示存在細(xì)胞晶粒、位錯(cuò)堆積和沉淀,，表明晶界和位錯(cuò)強(qiáng)化（圖1F）,。此外，Zn-Mg-Cu的HRTEM圖像顯示4H型長周期堆疊有序(LPSO)結(jié)構(gòu)（圖1J）,。根據(jù)高角度環(huán)形暗場(HAADF)圖像,，Mg和Cu元素交織并均勻分布在整個(gè)Zn基體中，表明固溶體強(qiáng)化。該映射進(jìn)一步表明,，AM技術(shù)能夠強(qiáng)化元素在Zn基體中的溶解,，從而減輕元素偏析。   

圖1 鋅合金梯度螺旋支架的表征

2.降解和電化學(xué)行為
作者進(jìn)一步評(píng)估了鋅合金梯度螺旋支架的降解行為,。降解28天后,，鋅合金支架表面可見白色降解產(chǎn)物。所有支架均未觀察到明顯的部分失效,，且與鋅鎂支架相比,，鋅-鎂-銅支架的降解產(chǎn)物生成更均勻（圖2A）。SEM 觀察表明,，Zn-Mg-Cu支架表面自發(fā)形成了微小的球形顆粒,。降解的Zn-Mg-Cu支架的EDS映射表明，支架上形成的白色化合物含有Zn,、Ca,、O、P和Cl元素（圖2B）,。仿生磷酸鈣(CaP)化合物具有生物相容性和骨傳導(dǎo)性,，可以增強(qiáng)血管生成和骨形成。

此外,，作者還構(gòu)建了計(jì)算流體力學(xué)（CFD）模型來分析梯度螺旋結(jié)構(gòu)的傳質(zhì)行為,。通過CFD模擬計(jì)算得出了滲透率和壓降，如速度和壓力云圖（圖2C）所示,。模型表現(xiàn)出不規(guī)則的速度分布,，孔隙中心的速度最高。大多數(shù)區(qū)域的流速較低（<1.5 mm/s）,，為細(xì)胞粘附和增強(qiáng)氧氣運(yùn)輸提供了合適的環(huán)境,。為分析合金元素引起的劣化模式差異，采用動(dòng)電位極化（PDP）和電化學(xué)阻抗譜（EIS）測試方法評(píng)估了鋅合金的電化學(xué)腐蝕特性,。與鋅相比,，鋅合金的腐蝕電位向負(fù)方向移動(dòng)（圖2D）。奈奎斯特圖（圖2E）表明,，鋅-鎂合金在低頻下比鋅具有更大的阻抗環(huán),，表明腐蝕趨勢增加。

圖2 鋅合金的體外抗菌及生物相容性性能

3.抗菌特性及生物相容性表征
在頜面部,，由于解剖部位的開放性,，骨植入物往往面臨更復(fù)雜的微生物學(xué)挑戰(zhàn)，這可能導(dǎo)致更高的骨再生失敗風(fēng)險(xiǎn),。因此，Zn合金植入物已被設(shè)計(jì)成具有增強(qiáng)的抗菌性能，以有效管理微生物并成功重建缺損,。作者以革蘭氏陽性金黃色葡萄球菌(S. aureus)和革蘭氏陰性大腸桿菌(E. coli)評(píng)估了Zn合金的抗菌活性,。將各種Zn合金與細(xì)菌共培養(yǎng)，并使用SEM觀察其形態(tài),。結(jié)果發(fā)現(xiàn),，當(dāng)與Zn-Mg-Cu組一起培養(yǎng)時(shí)，金黃色葡萄球菌和大腸桿菌均表現(xiàn)出顯著的收縮和損傷（圖3A）,。此外,，使用平板涂布法進(jìn)行了細(xì)菌粘附試驗(yàn)，對(duì)照組瓊脂平板幾乎完全被金黃色葡萄球菌和大腸桿菌菌落覆蓋,，而鋅合金上的菌落數(shù)量明顯較少,，鋅-鎂-銅合金上僅觀察到少量菌落（圖3B）。鋅-鎂-銅組的抑菌率顯著提高,，達(dá)到純鋅的4.5倍和鋅-鎂組的2.6倍（圖3C）,。這些結(jié)果證實(shí)了鋅-鎂-銅組對(duì)控制細(xì)菌感染是優(yōu)異成效。   

成骨細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞在骨再生過程中起著至關(guān)重要的作用,，對(duì)于確定植入物的生物相容性至關(guān)重要,。在本研究中，成骨細(xì)胞前體細(xì)胞系MC3T3-E1和內(nèi)皮細(xì)胞系HUVEC用于評(píng)估鋅合金植入物的體外生物相容性,。將MC3T3和HUVEC細(xì)胞與濃度為25%的各種鋅合金提取物共培養(yǎng)以評(píng)估材料對(duì)細(xì)胞增殖的影響,。鋅-鎂-銅組表現(xiàn)出最明顯的增殖增強(qiáng)潛力（圖3D）。此外,，使用活/死染色評(píng)估了不同鋅合金對(duì)MC3T3和HUVEC細(xì)胞的細(xì)胞毒性,。孵育24小時(shí)后，所有組中幾乎沒有死細(xì)胞被染成紅色,，這表明鋅合金植入物表現(xiàn)出良好的生物相容性,，沒有任何明顯的細(xì)胞毒性作用（圖3E）。

圖3 抗菌性能和生物相容性的探究

4.模擬高血糖微環(huán)境中的體外血管生成潛力
骨再生過程與血管生成過程密切相關(guān),。作為一種全身代謝性疾病,，糖尿病常常伴有多種血管功能障礙。在高糖杜氏改良的Eagle培養(yǎng)基中培養(yǎng)的HUVEC細(xì)胞用于體外評(píng)估鋅合金在高血糖微環(huán)境中的血管生成性能,。免疫熒光染色顯示,，高糖環(huán)境中的HUVEC細(xì)胞擴(kuò)散不良，細(xì)胞擴(kuò)散面積減少,。但所有鋅合金組中高糖引起的細(xì)胞收縮都得到部分緩解,，表明細(xì)胞活力提高（圖4A）�,；�于此進(jìn)行了細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn),，以評(píng)估不同鋅合金提取物對(duì)HUVEC的體外遷移能力，如圖4B所示，與高糖組相比,，在用鋅合金提取物孵育24小時(shí)后,，劃痕寬度明顯減小。Zn-Mg-Cu組的愈合率達(dá)到80%,，幾乎與正常組相當(dāng),，這凸顯了其在促進(jìn)HUVEC遷移方面的有效性（圖4D）。   

作者進(jìn)一步使用小管形成試驗(yàn)評(píng)估了鋅合金誘導(dǎo)血管生成的潛力,。如圖4C所示,，高葡萄糖阻礙了HUVEC細(xì)胞中的小管形成，導(dǎo)致與對(duì)照組相比,，小管脆弱且不完整,。施用Zn-Mg-Cu提取物后，觀察到更多具有良好形態(tài)特征的毛細(xì)血管網(wǎng)絡(luò)（圖4C）,。定量分析顯示,，相應(yīng)的網(wǎng)格、節(jié)點(diǎn)和總長度高于其他治療組,，表明Zn-Mg-Cu組具有促進(jìn)血管形成的調(diào)節(jié)能力（圖4E）,。此外，Zn-Mg-Cu組顯著減輕了高葡萄糖環(huán)境對(duì)HUVEC中VEGF蛋白表達(dá)（圖4F-G）的抑制作用,�,？傊�，Zn-Mg-Cu組增強(qiáng)了HUVEC在模擬高血糖微環(huán)境中的血管生成能力,，為長期骨再生創(chuàng)造了有利的環(huán)境   

圖4 模擬高血糖微環(huán)境中鋅合金的體外血管生成潛力

5.模擬高血糖微環(huán)境中成骨細(xì)胞的體外成骨分化
接下來,，作者使用高糖培養(yǎng)基DMEM研究了鋅合金對(duì)模擬高血糖微環(huán)境中MC3T3-E1細(xì)胞成骨分化的影響。通過ALP染色評(píng)估細(xì)胞的功能狀態(tài),，高糖(HG)組在任何時(shí)間點(diǎn)均無明顯的ALP陽性染色,。14天后，Zn-Mg-Cu組的ALP活性超過Zn-Mg合金組,，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,，茜素紅染色進(jìn)一步支持了這一結(jié)果（圖5A）。為了進(jìn)一步在分子生物學(xué)水平上評(píng)估鋅合金的成骨作用,，進(jìn)行了成骨相關(guān)基因的qRT-PCR檢測,。與單獨(dú)使用相比，當(dāng)鋅,、鎂和銅協(xié)同作用時(shí),，成骨分化能力顯著增強(qiáng)。此外,，免疫熒光染色顯示,，在用Zn-Mg-Cu提取物培養(yǎng)的MC3T3細(xì)胞中,，骨鈣素（最豐富的成骨細(xì)胞特異性蛋白，與骨形成的葡萄糖代謝有關(guān)有所增加（圖5D）,。此外,，還進(jìn)行了蛋白質(zhì)印跡分析，以評(píng)估模擬高血糖微環(huán)境中第14天MC3T3細(xì)胞的成骨分化能力,。Zn-Mg-Cu在成骨相關(guān)蛋白（RUNX2和OCN）方面表現(xiàn)出更高的產(chǎn)量。這些結(jié)果表明,，Zn-Mg-Cu對(duì)促進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)礦化和鈣沉積的顯著作用可能是通過調(diào)節(jié)模擬高血糖微環(huán)境中成骨細(xì)胞的葡萄糖代謝來實(shí)現(xiàn)的,。   

圖5 模擬高血糖微環(huán)境中鋅合金植入物誘導(dǎo)的體外成骨分化

6.鋅合金支架誘導(dǎo)糖尿病兔下頜骨缺損骨再生的體內(nèi)評(píng)價(jià)   
最后，作者進(jìn)行了植入實(shí)驗(yàn)以測試不同鋅合金支架在糖尿病條件下的生物安全性和促成骨作用,，建立了糖尿病兔下頜骨缺損模型,。糖尿病兔在術(shù)后4和12周被人道處死，并切取下頜骨進(jìn)行進(jìn)一步分析,。進(jìn)行Micro-CT掃描以觀察下頜骨缺損的新骨形成結(jié)果,。下頜骨缺損的3D重建和冠狀圖像顯示新骨滲透并生長到鋅合金支架的多孔結(jié)構(gòu)中，而未植入的糖尿病組則觀察到明顯的骨凹陷（圖6A）,。根據(jù)定量顯微CT分析和重建圖像,，植入后4周，Zn-Mg和Zn-Mg-Cu支架周圍的新骨明顯比Zn植入物更廣泛,。利用Micro-CT評(píng)估了Zn-Mg-Cu植入物的體內(nèi)降解行為,。植入后4周和12周，Zn合金支架未發(fā)生明顯斷裂,。因此,，Zn合金支架能夠保持機(jī)械完整性并防止骨愈合過程中的早期機(jī)械故障。

為了進(jìn)一步定位新骨形成的部位,，進(jìn)行了鈣黃綠素?zé)晒鈽?biāo)記,。組織學(xué)和熒光顯微鏡照片顯示，礦化物可以沿著植入物的曲面不斷沉積和生長,，植入12周后可以在Zn-Mg-Cu支架周圍觀察到更多結(jié)構(gòu)良好的新骨,，而對(duì)照組則出現(xiàn)彌漫性礦化和炎癥組織（圖6C-D）。與鈣黃綠素染色結(jié)果一致,，Van Gieson染色顯示在4周和12周時(shí)材料-組織界面處形成了染成鮮紅色的膠原纖維,，并長入Zn-Mg-Cu的梯度孔隙中（圖6E）�,？傮w而言,，通過摻入Mg和Cu元素以及梯度結(jié)構(gòu)構(gòu)建，Zn-Mg-Cu支架有可能在高血糖微環(huán)境下提供更積極的愈合過程和更快的骨再生,。   

圖6 體內(nèi)評(píng)估鋅合金支架在糖尿病兔下頜骨缺損中誘導(dǎo)骨再生的作用

綜上,，本文通過增材制造可降解的Zn-Mg-Cu梯度支架,，開發(fā)了一種材料結(jié)構(gòu)驅(qū)動(dòng)的糖尿病頜面骨再生策略。通過邊界工程策略對(duì)Mg和Cu進(jìn)行原位合金化,，支架表現(xiàn)出良好的機(jī)械強(qiáng)度和均勻的降解模式,。雙金屬離子的同時(shí)釋放促進(jìn)了模擬高血糖微環(huán)境中細(xì)菌的消除和成骨細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞的增殖，從而在體外表現(xiàn)出良好的成骨和血管生成能力,。此外,，梯度結(jié)構(gòu)的仿生拓?fù)浜瓦m當(dāng)?shù)臐B透性增強(qiáng)了骨愈合過程中的骨傳導(dǎo)性，從而改善了糖尿病兔下頜骨缺損模型中新骨的生長和形成,�,？偟膩碚f，該工作為梯度Zn-Mg-Cu支架在治療糖尿病頜面骨缺損中的臨床應(yīng)用潛力指明了方向,。   

文章來源：
https://doi.org/10.1016/j.bioactmat.2024.06.028