增材制造構(gòu)建可生物降解的金屬支架用于糖尿病頜面骨再生

來源： EngineeringForLife

創(chuàng)傷和疾病引起的頜面骨缺損可導(dǎo)致生理功能障礙（咀嚼、言語和呼吸）以及心理傷害。由于人口老齡化和城市生活相關(guān)的不健康飲食，與糖尿病（DM）相關(guān)的頜面骨缺損的患病率持續(xù)上升。由于咬合負荷和高血糖微環(huán)境，糖尿病相關(guān)頜面骨缺損的再生仍然具有挑戰(zhàn)性。

針對此問題，來自華中科技大學同濟醫(yī)學院口腔醫(yī)學院的陳莉莉/華中科技大學同濟醫(yī)學院附屬協(xié)和醫(yī)院口腔科的許智/趙丹雷提出了一種材料結(jié)構(gòu)驅(qū)動的策略，通過增材制造可降解的Zn-Mg-Cu梯度支架。Mg和Cu的原位合金化賦予Zn合金良好的抗壓強度以提供機械支撐，并具有均勻的降解模式以防止局部破裂。該支架在模擬的高血糖微環(huán)境中表現(xiàn)出良好的抗菌、血管生成和成骨調(diào)節(jié)能力。

相關(guān)研究成果以“Additive manufacturing of degradable metallic scaffolds for material-structure-driven diabetic maxillofacial bone regeneration”為題于2024年6月29日發(fā)表在《Bioactive Materials》上。  

方案1 用于材料結(jié)構(gòu)驅(qū)動的糖尿病頜面骨再生的Zn-Mg-Cu梯度支架示意圖

1.鋅合金梯度螺旋支架的表征
為了實現(xiàn)材料結(jié)構(gòu)驅(qū)動的骨再生，作者利用激光增材制造(AM)技術(shù)制造了可降解鋅合金梯度螺旋支架。首先檢查了鋅合金支架的可打印性、微觀結(jié)構(gòu)特征和力學行為（圖1）。梯度螺旋支架由具有良好且致密的表面過渡的鋅合金粉末制備而成，可產(chǎn)生雙曲面和梯度拓撲結(jié)構(gòu)（80%–60%的孔隙率）。微觀結(jié)構(gòu)分析表明，細小的細胞和柱狀亞結(jié)構(gòu)隨機分布在鋅合金中，而鋅中的板條晶粒則細長而粗大。

為了理解合金元素和AM技術(shù)引起的強化機制，作者對Zn-Mg-Cu合金進行了TEM觀察。明場圖像顯示存在細胞晶粒、位錯堆積和沉淀，表明晶界和位錯強化（圖1F）。此外，Zn-Mg-Cu的HRTEM圖像顯示4H型長周期堆疊有序(LPSO)結(jié)構(gòu)（圖1J）。根據(jù)高角度環(huán)形暗場(HAADF)圖像，Mg和Cu元素交織并均勻分布在整個Zn基體中，表明固溶體強化。該映射進一步表明，AM技術(shù)能夠強化元素在Zn基體中的溶解，從而減輕元素偏析。   

圖1 鋅合金梯度螺旋支架的表征

2.降解和電化學行為
作者進一步評估了鋅合金梯度螺旋支架的降解行為。降解28天后，鋅合金支架表面可見白色降解產(chǎn)物。所有支架均未觀察到明顯的部分失效，且與鋅鎂支架相比，鋅-鎂-銅支架的降解產(chǎn)物生成更均勻（圖2A）。SEM 觀察表明，Zn-Mg-Cu支架表面自發(fā)形成了微小的球形顆粒。降解的Zn-Mg-Cu支架的EDS映射表明，支架上形成的白色化合物含有Zn、Ca、O、P和Cl元素（圖2B）。仿生磷酸鈣(CaP)化合物具有生物相容性和骨傳導(dǎo)性，可以增強血管生成和骨形成。

此外，作者還構(gòu)建了計算流體力學（CFD）模型來分析梯度螺旋結(jié)構(gòu)的傳質(zhì)行為。通過CFD模擬計算得出了滲透率和壓降，如速度和壓力云圖（圖2C）所示。模型表現(xiàn)出不規(guī)則的速度分布，孔隙中心的速度最高。大多數(shù)區(qū)域的流速較低（<1.5 mm/s），為細胞粘附和增強氧氣運輸提供了合適的環(huán)境。為分析合金元素引起的劣化模式差異，采用動電位極化（PDP）和電化學阻抗譜（EIS）測試方法評估了鋅合金的電化學腐蝕特性。與鋅相比，鋅合金的腐蝕電位向負方向移動（圖2D）。奈奎斯特圖（圖2E）表明，鋅-鎂合金在低頻下比鋅具有更大的阻抗環(huán)，表明腐蝕趨勢增加。

圖2 鋅合金的體外抗菌及生物相容性性能

3.抗菌特性及生物相容性表征
在頜面部，由于解剖部位的開放性，骨植入物往往面臨更復(fù)雜的微生物學挑戰(zhàn)，這可能導(dǎo)致更高的骨再生失敗風險。因此，Zn合金植入物已被設(shè)計成具有增強的抗菌性能，以有效管理微生物并成功重建缺損。作者以革蘭氏陽性金黃色葡萄球菌(S. aureus)和革蘭氏陰性大腸桿菌(E. coli)評估了Zn合金的抗菌活性。將各種Zn合金與細菌共培養(yǎng)，并使用SEM觀察其形態(tài)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，當與Zn-Mg-Cu組一起培養(yǎng)時，金黃色葡萄球菌和大腸桿菌均表現(xiàn)出顯著的收縮和損傷（圖3A）。此外，使用平板涂布法進行了細菌粘附試驗，對照組瓊脂平板幾乎完全被金黃色葡萄球菌和大腸桿菌菌落覆蓋，而鋅合金上的菌落數(shù)量明顯較少，鋅-鎂-銅合金上僅觀察到少量菌落（圖3B）。鋅-鎂-銅組的抑菌率顯著提高，達到純鋅的4.5倍和鋅-鎂組的2.6倍（圖3C）。這些結(jié)果證實了鋅-鎂-銅組對控制細菌感染是優(yōu)異成效。   

成骨細胞和內(nèi)皮細胞在骨再生過程中起著至關(guān)重要的作用，對于確定植入物的生物相容性至關(guān)重要。在本研究中，成骨細胞前體細胞系MC3T3-E1和內(nèi)皮細胞系HUVEC用于評估鋅合金植入物的體外生物相容性。將MC3T3和HUVEC細胞與濃度為25%的各種鋅合金提取物共培養(yǎng)以評估材料對細胞增殖的影響。鋅-鎂-銅組表現(xiàn)出最明顯的增殖增強潛力（圖3D）。此外，使用活/死染色評估了不同鋅合金對MC3T3和HUVEC細胞的細胞毒性。孵育24小時后，所有組中幾乎沒有死細胞被染成紅色，這表明鋅合金植入物表現(xiàn)出良好的生物相容性，沒有任何明顯的細胞毒性作用（圖3E）。

圖3 抗菌性能和生物相容性的探究

4.模擬高血糖微環(huán)境中的體外血管生成潛力
骨再生過程與血管生成過程密切相關(guān)。作為一種全身代謝性疾病，糖尿病常常伴有多種血管功能障礙。在高糖杜氏改良的Eagle培養(yǎng)基中培養(yǎng)的HUVEC細胞用于體外評估鋅合金在高血糖微環(huán)境中的血管生成性能。免疫熒光染色顯示，高糖環(huán)境中的HUVEC細胞擴散不良，細胞擴散面積減少。但所有鋅合金組中高糖引起的細胞收縮都得到部分緩解，表明細胞活力提高（圖4A）。基于此進行了細胞劃痕實驗，以評估不同鋅合金提取物對HUVEC的體外遷移能力，如圖4B所示，與高糖組相比，在用鋅合金提取物孵育24小時后，劃痕寬度明顯減小。Zn-Mg-Cu組的愈合率達到80%，幾乎與正常組相當，這凸顯了其在促進HUVEC遷移方面的有效性（圖4D）。   

作者進一步使用小管形成試驗評估了鋅合金誘導(dǎo)血管生成的潛力。如圖4C所示，高葡萄糖阻礙了HUVEC細胞中的小管形成，導(dǎo)致與對照組相比，小管脆弱且不完整。施用Zn-Mg-Cu提取物后，觀察到更多具有良好形態(tài)特征的毛細血管網(wǎng)絡(luò)（圖4C）。定量分析顯示，相應(yīng)的網(wǎng)格、節(jié)點和總長度高于其他治療組，表明Zn-Mg-Cu組具有促進血管形成的調(diào)節(jié)能力（圖4E）。此外，Zn-Mg-Cu組顯著減輕了高葡萄糖環(huán)境對HUVEC中VEGF蛋白表達（圖4F-G）的抑制作用。總之，Zn-Mg-Cu組增強了HUVEC在模擬高血糖微環(huán)境中的血管生成能力，為長期骨再生創(chuàng)造了有利的環(huán)境   

圖4 模擬高血糖微環(huán)境中鋅合金的體外血管生成潛力

5.模擬高血糖微環(huán)境中成骨細胞的體外成骨分化
接下來，作者使用高糖培養(yǎng)基DMEM研究了鋅合金對模擬高血糖微環(huán)境中MC3T3-E1細胞成骨分化的影響。通過ALP染色評估細胞的功能狀態(tài)，高糖(HG)組在任何時間點均無明顯的ALP陽性染色。14天后，Zn-Mg-Cu組的ALP活性超過Zn-Mg合金組，差異有統(tǒng)計學意義，茜素紅染色進一步支持了這一結(jié)果（圖5A）。為了進一步在分子生物學水平上評估鋅合金的成骨作用，進行了成骨相關(guān)基因的qRT-PCR檢測。與單獨使用相比，當鋅、鎂和銅協(xié)同作用時，成骨分化能力顯著增強。此外，免疫熒光染色顯示，在用Zn-Mg-Cu提取物培養(yǎng)的MC3T3細胞中，骨鈣素（最豐富的成骨細胞特異性蛋白，與骨形成的葡萄糖代謝有關(guān)有所增加（圖5D）。此外，還進行了蛋白質(zhì)印跡分析，以評估模擬高血糖微環(huán)境中第14天MC3T3細胞的成骨分化能力。Zn-Mg-Cu在成骨相關(guān)蛋白（RUNX2和OCN）方面表現(xiàn)出更高的產(chǎn)量。這些結(jié)果表明，Zn-Mg-Cu對促進細胞外基質(zhì)礦化和鈣沉積的顯著作用可能是通過調(diào)節(jié)模擬高血糖微環(huán)境中成骨細胞的葡萄糖代謝來實現(xiàn)的。   

圖5 模擬高血糖微環(huán)境中鋅合金植入物誘導(dǎo)的體外成骨分化

6.鋅合金支架誘導(dǎo)糖尿病兔下頜骨缺損骨再生的體內(nèi)評價   
最后，作者進行了植入實驗以測試不同鋅合金支架在糖尿病條件下的生物安全性和促成骨作用，建立了糖尿病兔下頜骨缺損模型。糖尿病兔在術(shù)后4和12周被人道處死，并切取下頜骨進行進一步分析。進行Micro-CT掃描以觀察下頜骨缺損的新骨形成結(jié)果。下頜骨缺損的3D重建和冠狀圖像顯示新骨滲透并生長到鋅合金支架的多孔結(jié)構(gòu)中，而未植入的糖尿病組則觀察到明顯的骨凹陷（圖6A）。根據(jù)定量顯微CT分析和重建圖像，植入后4周，Zn-Mg和Zn-Mg-Cu支架周圍的新骨明顯比Zn植入物更廣泛。利用Micro-CT評估了Zn-Mg-Cu植入物的體內(nèi)降解行為。植入后4周和12周，Zn合金支架未發(fā)生明顯斷裂。因此，Zn合金支架能夠保持機械完整性并防止骨愈合過程中的早期機械故障。

為了進一步定位新骨形成的部位，進行了鈣黃綠素熒光標記。組織學和熒光顯微鏡照片顯示，礦化物可以沿著植入物的曲面不斷沉積和生長，植入12周后可以在Zn-Mg-Cu支架周圍觀察到更多結(jié)構(gòu)良好的新骨，而對照組則出現(xiàn)彌漫性礦化和炎癥組織（圖6C-D）。與鈣黃綠素染色結(jié)果一致，Van Gieson染色顯示在4周和12周時材料-組織界面處形成了染成鮮紅色的膠原纖維，并長入Zn-Mg-Cu的梯度孔隙中（圖6E）。總體而言，通過摻入Mg和Cu元素以及梯度結(jié)構(gòu)構(gòu)建，Zn-Mg-Cu支架有可能在高血糖微環(huán)境下提供更積極的愈合過程和更快的骨再生。   

圖6 體內(nèi)評估鋅合金支架在糖尿病兔下頜骨缺損中誘導(dǎo)骨再生的作用

綜上，本文通過增材制造可降解的Zn-Mg-Cu梯度支架，開發(fā)了一種材料結(jié)構(gòu)驅(qū)動的糖尿病頜面骨再生策略。通過邊界工程策略對Mg和Cu進行原位合金化，支架表現(xiàn)出良好的機械強度和均勻的降解模式。雙金屬離子的同時釋放促進了模擬高血糖微環(huán)境中細菌的消除和成骨細胞和內(nèi)皮細胞的增殖，從而在體外表現(xiàn)出良好的成骨和血管生成能力。此外，梯度結(jié)構(gòu)的仿生拓撲和適當?shù)臐B透性增強了骨愈合過程中的骨傳導(dǎo)性，從而改善了糖尿病兔下頜骨缺損模型中新骨的生長和形成。總的來說，該工作為梯度Zn-Mg-Cu支架在治療糖尿病頜面骨缺損中的臨床應(yīng)用潛力指明了方向。   

文章來源：
https://doi.org/10.1016/j.bioactmat.2024.06.028