華南理工曹曉東團(tuán)隊：用于軟骨再生的載干細(xì)胞3D打印絲素蛋白/明膠支架

來源： EFL生物3D打印與生物制造

關(guān)節(jié)軟骨組織一經(jīng)運動損傷或疾病很難實現(xiàn)自愈，目前治療軟骨缺損的方法有骨髓刺激,、自體骨軟骨移植、基質(zhì)誘導(dǎo)自體軟骨細(xì)胞修復(fù)手術(shù)等,，但這些方法仍存在供體不足,、纖維軟骨再生等問題。因此,，如何有效的修復(fù)軟骨損傷仍是一大挑戰(zhàn),。近期，來自華南理工的曹曉東教授團(tuán)隊采用擠出式低溫3D打印技術(shù),，通過辣根過氧化物酶( HRP )介導(dǎo)絲素蛋白( SF )和酪胺改性明膠( GT )交聯(lián),，制備了多孔水凝膠支架，并結(jié)合干細(xì)胞聚集體接種實現(xiàn)促進(jìn)II型膠原高表達(dá),，向透明軟骨分化,，提升關(guān)節(jié)軟骨再生修復(fù)效果。相關(guān)論文“3D printed silk-gelatin hydrogel scaffold with different porous structure and cell seeding strategy for cartilage regeneration”發(fā)表于雜志Bioactive Materials上,。

首先,，研究人員通過利用3D打印技術(shù)并結(jié)合明膠溫敏性和雙氧水浸泡成膠方式制備了具有連通孔結(jié)構(gòu)的3D打印水凝膠支架（圖 1），且采用光學(xué)顯微鏡和掃描電鏡（SEM）評估了3D打印水凝膠支架表面和橫截面的形態(tài)（圖2）,。

圖1 3D打印水凝膠支架合成示意圖

圖2 3D打印水凝膠支架表面和橫截面圖

為分析SF-GT水凝膠的力學(xué)性能,，研究人員通過傅里葉變換紅外光譜（FTIR）和壓縮實驗證實了3D打印水凝膠支架具有良好的抗壓縮和抗疲勞特性,，可為組織工程軟骨發(fā)揮支撐作用（圖3）,。

圖3 不同3D打印水凝膠支架的FTIR光譜

隨后，研究人員通過加入絲素蛋白并引發(fā)其分子構(gòu)象轉(zhuǎn)變提升了水凝膠的力學(xué)性能,、延長了降解時間,，同時保有較高的孔隙率，各項理化性能測試均顯示了SF5GT15/醇處理支架最適合作為軟骨組織再生支架材料,，并采用活/死染色法驗證了SF-GT水凝膠支架具有良好的生物相容性（圖4）,。

圖4 不同水凝膠支架的理化性能測試

其次，研究人員開發(fā)了具有貫通孔(TH)和錯位孔(SH)的兩種支架，實驗結(jié)果表明改變支架內(nèi)部纖維絲的空間排列,，可成功打印出錯位孔支架和貫通孔支架,，這兩種支架在孔隙率和力學(xué)性能上沒有顯著性差異，但錯位孔可提高細(xì)胞接種效率（圖5）,。

圖5 水凝膠支架內(nèi)部結(jié)構(gòu)的電鏡掃描圖

接著,，研究人員對比了細(xì)胞懸液(CS)和細(xì)胞聚集體(CA)兩種細(xì)胞接種方法，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞聚集體接種可以使細(xì)胞有效地滲透到支架中,，獲得細(xì)胞在整個結(jié)構(gòu)中的空間分布,，從而形成高質(zhì)量的基質(zhì)組織（圖6），并通過體外成軟骨誘導(dǎo)實驗證明,，在相同誘導(dǎo)條件下,，以細(xì)胞聚集體接種的方式，有利于維持圓形形態(tài)干細(xì)胞的聚集,，促進(jìn)干細(xì)胞表達(dá)并分泌較多的 II 型膠原,，有利于干細(xì)胞向透明軟骨分化；而以細(xì)胞懸液接種的方式,，干細(xì)胞表達(dá)并分泌更多的 I 型膠原,，干細(xì)胞傾向于向纖維軟骨分化（圖7、圖8）,。

圖6 細(xì)胞活/死染色

圖7 體外培養(yǎng)的CA/SH和CS/SH軟骨形成

圖8 3D打印水凝膠支架上CS和CA的軟骨分化

最后,，研究人員通過兔關(guān)節(jié)軟骨缺損模型評估了負(fù)載干細(xì)胞聚集體的錯位孔支架對軟骨缺損修復(fù)的作用，對比了12周和16周的修復(fù)情況（圖9）以及多種組織學(xué)染色結(jié)果（圖10）,，表明了采用細(xì)胞聚集體接種的錯位孔支架可有效實現(xiàn)關(guān)節(jié)軟骨的再生修復(fù),。

圖9 體外動物實驗

圖10 體內(nèi)再生軟骨的組織學(xué)評估

綜上所述，本研究通過將3D打印的SF-GT水凝膠和干細(xì)胞聚集體結(jié)合,，開發(fā)了一種有效的軟骨組織工程方法,，構(gòu)建了理化性能高度仿生的軟骨組織工程支架，還設(shè)計了體外實驗來評價組織工程軟骨的形成,，最后通過體內(nèi)研究表明,，采用細(xì)胞聚集接種法制備的3D打印SF5GT15水凝膠在促進(jìn)軟骨再生修復(fù)方面具有廣闊的臨床應(yīng)用前景。

文章來源：
https://doi.org/10.1016/j.bioactmat.2021.03.013