如何利用3D打印技術(shù)制備載細(xì)胞復(fù)合水凝膠體系促進(jìn)骨軟骨再生

來源： EngineeringForLife

隨著老齡化人口和運(yùn)動(dòng)損傷率的上升,，骨軟骨 (OC) 缺損正成為一個(gè)嚴(yán)重的全球健康問題,，組織工程植入物為缺損區(qū)域提供機(jī)械支撐，并作為生物活性因子載體招募原位細(xì)胞或重塑局部不利微環(huán)境,，提示了 OC 再生的潛在替代方法,。

本期，EFL以發(fā)表在雜志《The Innovation》的“3D-bioprinted anisotropic bicellular living hydrogels boost osteochondral regeneration via reconstruction of cartilage–bone interface”研究為例,，解析如何利用由甲基丙烯�,；�明膠（GelMA） 和甲基丙烯酰化海藻酸鹽 (AlgMA) 制成的復(fù)合水凝膠作為生物墨水,，精確打印同時(shí)將關(guān)節(jié)軟骨祖細(xì)胞 (ACPC) 和骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞 (BMSC) 嵌入分層中的各向異性雙細(xì)胞活水凝膠 (ABLH),，促進(jìn)骨軟骨再生。   

為什么選擇ABLH

甲基丙烯�,；�明膠（GelMA）具有出色的打印能力和快速的光交聯(lián)特點(diǎn),，可提高生物打印的可行性�,；�于GelMA 出色的生物相容性和 AlgMA 的易操作性,，該研究通過雙通道擠出生物3D打印技術(shù)制造了由 GelMA 和AlgMA組成的各向異性雙細(xì)胞活水凝膠 (ABLH),。可將軟骨來源的ACPC和骨髓來源的 BMSC分配到 ABLH 的分層中,，保持了高細(xì)胞活力,。此外，與均質(zhì)水凝膠相比,，ABLH 中的新軟骨和軟骨下骨同步再生率更高,，能夠調(diào)節(jié)的軟骨-骨-血管串?dāng)_，實(shí)現(xiàn)更好的軟骨-骨界面,。

如何制備ABLH

（1）GelMA和AlgMA的合成及生物墨水制備：將類型A豬皮明膠或海藻酸鈉分別溶解在50°C的PBS中,，然后分別加入甲基丙烯酸酐進(jìn)行反應(yīng)。之后,，將溶液稀釋并在40°C下用蒸餾水透析3天,，冷凍干燥3天。在使用前分別進(jìn)行2小時(shí)的紫外線滅菌,，隨后將GelMA溶解在37°C的PBS中,，加入光引發(fā)劑和AlgMA，攪拌均勻,，并加入懸浮細(xì)胞，制備成生物墨水,。（EFL可提供系列GelMA和AlgMA水凝膠產(chǎn)品,，詳詢文末區(qū)域銷售）

（2）ABLHs的生物打印：使用3D生物打印機(jī)進(jìn)行生物打印,，在室溫下以70 kPa的壓力擠出不同比例的生物墨水,，逐漸增加擠出壓力直到線條順利擠出或達(dá)到最大70 kPa，針頭尺寸為0.3 mm,，線條間距設(shè)為0.5 mm,。（EFL可提供系列擠出式生物3D打印機(jī)，點(diǎn)擊鏈接,，查看詳情）

ABLH的優(yōu)勢(shì)和作用

（1）ABLH具有較好的物理機(jī)械性能和生物相容性
當(dāng) GelMA 和 AlgMA 混合時(shí),，復(fù)合生物墨水保持有效的剪切稀化行為和溫度相關(guān)模量，能夠快速交聯(lián),。在室溫下以細(xì)胞友好的擠出壓力直接打印,，并在光交聯(lián)后保持構(gòu)建體的穩(wěn)定結(jié)構(gòu)。此外,，ABLH具有較好的生物相容性,，適用于 OC 再生，其中7G3A 是進(jìn)一步研究的最佳比例,。其上方為 ACPC（3 毫米高）,，下方為 BMSC（5 毫米高）（圖1）,。

圖1 復(fù)合生物墨水的制備和可打印性

（2）ABLH 的體外異質(zhì)譜系分化
分別從兔軟骨和骨髓中分離的軟骨祖細(xì)胞 ACPC 和骨祖細(xì)胞 BMSC 在體外單層培養(yǎng)中進(jìn)行表征和比較。兩種細(xì)胞形態(tài)相似,，然而,，BMSC 的克隆形成和增殖能力比 ACPC 強(qiáng)。隨后,，使用 3D 生物打印制備了 ACPC 或 BMSC 負(fù)載水凝膠,，由于在生理溫度下可打印的優(yōu)勢(shì)，生物打印水凝膠促進(jìn)了內(nèi)部細(xì)胞的存活,、增殖和擴(kuò)散,。在體外雙層模型中可見，水凝膠一層為無(wú)細(xì)胞層,，另一層包裹細(xì)胞,，ACPCs 和 BMSCs 分別在 7 或 14 天內(nèi)擴(kuò)散（圖2）。

圖2 復(fù)合生物打印水凝膠支持嵌入細(xì)胞的存活和增殖

為了進(jìn)一步評(píng)估兩種細(xì)胞類型在早期或晚期的定向分化的潛力,，將含有 ACPC 或 BMSC 的水凝膠分別暴露于軟骨或成骨培養(yǎng)基中進(jìn)行 7 或 14 天的誘導(dǎo),。軟骨特異性基因（Col2a1、Acan 和 Sox9）的表達(dá)水平在體外分化過程中逐漸增加,。番紅 O 染色顯示,，在含有 ACPC 的水凝膠中，C-ECM 逐漸改善,，免疫組織化學(xué)染色顯示COLII和ACAN 的表達(dá)在 3D 培養(yǎng)平臺(tái)中顯著增加,。差異表達(dá)基因的熱圖顯示，軟骨形成正調(diào)控基因的表達(dá)水平增加,，但負(fù)調(diào)控基因的表達(dá)水平受到抑制,。深入的通路分析表明，激活的線粒體 ATP 合成和氧化磷酸化與 ACPC 向軟骨細(xì)胞譜系分化有關(guān),。骨特異性標(biāo)志物的表達(dá)水平在 BMSC 負(fù)載水凝膠中上調(diào),，茜素紅染色可見O-ECM逐漸增強(qiáng)。熱圖顯示成骨正調(diào)控基因Gli3,、Ddr2 和 Bmp2/4/7 26 的表達(dá)水平顯著增加,，同時(shí)負(fù)調(diào)控基因Mdk、Hdac7和Grem1的表達(dá)被抑制,。除此之外,，在 BMSC 分化為成骨細(xì)胞譜系時(shí)還發(fā)現(xiàn)了晝夜節(jié)律信號(hào)傳導(dǎo)。綜上所述,，ABLH 在體外 3D 培養(yǎng)中分別促進(jìn)了 ACPC 或 BMSC 的成軟骨和成骨分化（圖3）,。  

圖3 負(fù)載ACPC 或 BMSC 的生物打印結(jié)構(gòu)對(duì)軟骨形成或成骨的影響

（3）ABLH 促進(jìn)體內(nèi)軟骨修復(fù)
為了探索 ABLH 在軟骨或骨再生方面的潛在治療益處，在兔股骨滑車溝中建立了全層 OC 缺損模型。根據(jù)術(shù)后 6 周的大體和組織形態(tài)學(xué)圖像,，缺損組中軟骨修復(fù)僅發(fā)生在主要由纖維結(jié)締組織組成的 C-ECM 稀少的表面,。無(wú)細(xì)胞水凝膠表現(xiàn)出脆弱的軟骨連接和空洞骨結(jié)構(gòu)，相比之下,，三種載細(xì)胞水凝膠表現(xiàn)出相對(duì)完整的 OC 單元,，形成了軟骨基質(zhì)豐富的區(qū)域，ABLH 有助于位于軟骨和軟骨下骨上部的 C-ECM合成,，此外,，手術(shù)后 12 周，除缺損組的 OC 單元不完整外,，四個(gè)水凝膠治療組的形態(tài)重建均已完成,，其中BMSC 水凝膠比 ACPC 水凝膠顯示出更完整的軟骨下骨結(jié)構(gòu)，ABLH 的軟骨再生效率比 ACPC 水凝膠高 23.5%,，總的來說,，這些發(fā)現(xiàn)表明 ABLH 促進(jìn)軟骨的修復(fù)和更新。

圖4 ABLH 促進(jìn)體內(nèi)軟骨再生

（4）ABLH 促進(jìn)體內(nèi)骨重塑
通過微型計(jì)算機(jī)斷層掃描分析和組織學(xué)觀察詳細(xì)檢查了 ABLH 對(duì)骨重建的潛在治療效果,。植入后 6 周,，與缺損組相比，無(wú)細(xì)胞水凝膠對(duì)骨量改善的作用有限,，表明僅靠機(jī)械支撐不足以推動(dòng)新骨形成,，ACPC 水凝膠傾向于在表面形成纖維組織狀連接，在深層留下囊腔,，不僅誘導(dǎo)下層骨重建,，還保持上軟骨層的完整性，提供合適的軟骨和骨發(fā)育環(huán)境,。成熟骨和COLI 的特異性染色顯示，雙細(xì)胞水凝膠實(shí)現(xiàn)了仿生骨再生,，具有高度自然的微觀結(jié)構(gòu),，與含有 BMSC 的水凝膠相比，骨結(jié)構(gòu)成熟度高出 20.8%（圖5）,。   

圖5 ABLH 加速了體內(nèi)軟骨下骨的形成和重塑

（5）ABLH 協(xié)調(diào)軟骨-骨-血管串?dāng)_以進(jìn)行 OC 單元重建
在體外軟骨生成的過程中,，攜帶ACPC的水凝膠中血管生成逐漸減弱，基因集富集分析（GSEA）進(jìn)一步證實(shí)了血管生成的抑制作用,�,；�于基因本體論（GO）的熱圖顯示，早期的軟骨生成過程中有新血管形成,，但在軟骨成熟和分化結(jié)束后,，這些血管的生成明顯減少。在體外成骨過程中，攜帶BMSC的水凝膠中血管生成逐漸增加,，GSEA分析證實(shí)了在分化過程中血管的逐步形成,，GO分析表明，血管生成,、重塑和新血管的擴(kuò)張對(duì)于成骨過程中骨基質(zhì)的重塑必不可少,。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中，通過免疫熒光染色可見,，BMSC水凝膠更傾向于促進(jìn)骨生成,，而含有ACPC的水凝膠更有利于軟骨生成。在骨關(guān)節(jié)炎的進(jìn)展過程中,，軟骨下骨區(qū)的H型血管數(shù)量增加,，甚至侵入軟骨組織，通過抑制H型血管的形成,，可以平衡軟骨代謝并減輕骨關(guān)節(jié)炎的癥狀,。在雙細(xì)胞水凝膠中，H 型血管被限制在骨層中,，而不會(huì)穿透和擾亂軟骨穩(wěn)態(tài),，對(duì)于獲得更和諧的軟骨-骨界面至關(guān)重要�,？傊�,，ABLH 重新配置了成骨細(xì)胞-軟骨細(xì)胞相互作用，以實(shí)現(xiàn)分層 OC 單元重建（圖6）,。   

圖6 ABLH 協(xié)調(diào)軟骨-骨-血管串?dāng)_以重建 OC 單元

總結(jié)

該研究構(gòu)建了負(fù)載細(xì)胞的ABLH,，可在室溫下直接打印，保持了細(xì)胞生長(zhǎng)和分化的能力,。在體外3D培養(yǎng)系統(tǒng)中,，ACPC可分化為軟骨細(xì)胞，BMSC可分化為成骨細(xì)胞,。原位植入的ABLH在體內(nèi)OC缺陷模型中實(shí)現(xiàn)了上層軟骨細(xì)胞外基質(zhì)（C-ECM）和下層骨細(xì)胞外基質(zhì)（O-ECM）的特異性重建,。從機(jī)制上看，ABLH通過時(shí)空調(diào)控軟骨-骨-血管的相互作用,，促進(jìn)了仿生OC單元的重塑,。該研究提出了一種利用活細(xì)胞的雙層水凝膠生物適應(yīng)性策略，為高效修復(fù)OC缺陷提供了一種全新的方法,。

文獻(xiàn)來源：
https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC10746383/