南開大學(xué)《ACS Nano》：蘆丁納米顆粒光抑制劑助力高效光基生物3D打印

來源： EFL生物3D打印與生物制造

數(shù)字光處理（DLP）3D打印技術(shù)以其高分辨率和高打印速度而備受關(guān)注,，其通過精密的逐層投影進行打印，能夠?qū)崿F(xiàn)生物材料在空間上的的精準(zhǔn)排列,，現(xiàn)已成為組織工程和再生醫(yī)學(xué)中不可或缺的重要工具,。然而，對于基于光基聚合的打印方式,，高保真度取決于對光-材料相互作用的精確控制,。在DLP打印過程中,，固有的光線散射以及不精確的固化深度控制使得自由基反應(yīng)在設(shè)計區(qū)域外發(fā)生，這些多余的聚合反應(yīng)會造成打印模型的扭曲和失真,，極大地影響了制造結(jié)構(gòu)的保真度,。為了減輕非預(yù)期聚合帶來的不良影響，在之前的研究中往往通過添加光吸收劑來在空間上限制光線的分布,，將光線最大程度地集中在單層的設(shè)計區(qū)域中,，以提高打印精度。然而,，這種基于光吸收的策略極大地耗散了激發(fā)光中的能量,，導(dǎo)致打印速度下降；同時也難以在充滿細(xì)胞的環(huán)境下發(fā)揮功能,。追根溯源,，一種更為全面、高效的策略不僅需要通過光吸收限制光的分布,，更應(yīng)該通過與自由基反應(yīng)，將自由基反應(yīng)嚴(yán)格地限制在設(shè)計區(qū)域內(nèi),，進一步提升加工精度,。同時，還需要考慮打印速度的提升以及適宜的細(xì)胞相容性,，以期實現(xiàn)一種高精度,、快速度和細(xì)胞親和的高效生物制造模式（圖1）。   

鑒于此,，南開大學(xué)孔德領(lǐng)教授,、博士后董顯豪聯(lián)合天津市第一中心醫(yī)院范猛主任在《ACS NANO》上發(fā)表題為“Efficient Light-Based Bioprinting via Rutin Nanoparticle Photoinhibitor for Advanced Biomedical Applications”的研究論文。利用天然黃酮類化合物中最廉價易得的蘆丁,，通過在溫和,、綠色的水溶液環(huán)境中簡單的一步自組裝方法，開發(fā)了一種新型水溶性光抑制添加劑——蘆丁納米顆粒（Rnps）,。Rnps能夠同時進行光吸收過程和自由基反應(yīng),，因此能夠抑制散射效應(yīng)，提升打印精度,。

圖1 Rnps的制備過程及其在光基生物打印中作為光抑制劑的特性示意圖

作者通過將蘆丁粉末溶解在NaOH溶液中,，此時蘆丁以蘆丁鈉鹽的形式存在（NaR），隨后通過調(diào)節(jié)pH使蘆丁和NaR發(fā)生分子間自組裝形成Rnps,。光吸收劑檸檬黃（Tar）由于其良好的生物相容性,，被廣泛用于各種生物制造中。因此,，作者選擇Tar作為對照,，比較了Rnps和Tar對405nm打印波長光線的吸收能力,，并檢測了不同濃度Rnps的自由基清除能力。結(jié)果表明,，Rnps對405nm光線的吸收能力與Tar不相上下,，且在水中表現(xiàn)出良好的ABTS自由基清除能力，有利于其在光—自由基打印中發(fā)揮有效功能（圖2）,。

圖2 Rnps的合成與表征   

為了驗證Rnps在生物墨水中發(fā)揮的具體作用,，作者以5% GelMA（EFL-GM）為例，測試了具有不同濃度Rnps的生物墨水的具體性質(zhì),，包括流變特性,、力學(xué)性能、穩(wěn)定性,、打印速率等,。使用EFL品牌的DLP生物3D打印機（EFL-BP8601 Pro）對打印，以便開展后續(xù)測試,。實驗結(jié)果證明,，Rnps的加入并不會影響打印支架的機械性能。相較于只進行光吸收的Tar,，Rnps的加入能夠改善打印的層間均質(zhì)性,，同時也抑制了打印過程中，由多余自由基反應(yīng)導(dǎo)致的墨水粘度提升,。此外,，加入0.1%Rnps的生物墨水展現(xiàn)出更快的制備速度，這有利于其在生物打印中的應(yīng)用（圖3）,。

圖3 光敏生物墨水配方和打印性能的優(yōu)化  

為了證明Rnps在提高打印分辨率和圖案保真度方面的能力,，作者通過打印輻條狀圖案來評估打印的橫向分辨率。隨著Rnps濃度的增加,，觀察到保真度提高,，且0.1% Rnps組獲得的最佳可打印分辨率顯著超過0.1% Tar組。打印精度的提高歸因于Rnps同時進行的光吸收和自由基清除過程,，說明該策略有效提高了打印精度和圖案細(xì)節(jié)的保真度,。接下來，作者研究了Rnps在多層豎直孔道結(jié)構(gòu)制造中的作用,。在打印直徑為2mm和1mm通道時,，0.1% Rnps組與0.1% Tar組相比，過固化和通道堵塞顯著減少,，這與Rnps在打印過程中抑制墨水粘度上升有關(guān),。結(jié)果分析表明，Rnps在打印更精細(xì)的孔道結(jié)構(gòu)時比傳統(tǒng)光吸收劑更具優(yōu)勢（圖4）。

圖4 通過富含Rnps的生物墨水提高打印分辨率和結(jié)構(gòu)保真度   

在生物打印中,，生物墨水的細(xì)胞相容性對于維持細(xì)胞的存活和增殖至關(guān)重要,。作者使用人誘導(dǎo)多能干細(xì)胞衍生的內(nèi)皮細(xì)胞（hiPSC-ECs）進行細(xì)胞種植和載細(xì)胞打印�,；�于打印精��,、速度和細(xì)胞兼容性進行篩選，最后選擇含有 0.1% Rnps 的生物墨水用于后續(xù)實驗,。蘆丁已被證實具備多種有益的生物活性,，包括抗炎特性、線粒體代謝調(diào)控,，以及顯著的抗凋亡能力,。作者為了驗證Rnps是否保留了抗氧化調(diào)節(jié)能力，在細(xì)胞經(jīng)Tar或Rnps處理后,，使用H2O2對其進行氧化刺激,，隨后分別測量胞內(nèi)ROS、超氧化物的濃度以及線粒體膜電位水平,。作者還通過qPCR驗證了抗氧化/抗凋亡相關(guān)基因表達的變化情況,。結(jié)果證實了Rnps在胞內(nèi)不僅參與自由基清除，同時也介導(dǎo)細(xì)胞修復(fù)和凋亡抵抗力增強,，賦予細(xì)胞抵抗氧化應(yīng)激和避免凋亡的卓越能力（圖5）,。

圖5 通過添加Rnps提高生物墨水的細(xì)胞兼容性、打印保真度和抗氧化性  

Rnps在復(fù)雜結(jié)構(gòu)制造和多材料打印中也展現(xiàn)了良好的性能,。作者采用含有Rnps的生物墨水，成功地制作具有TPMS結(jié)構(gòu)的復(fù)雜支架,，所得結(jié)構(gòu)特征薄壁的厚度在50到150μm之間,，在細(xì)節(jié)上顯示出高分辨率。同時,，由于Rnps對于多種生物墨水的良好兼容性,，使其能夠在多材料制備中發(fā)揮作用，以實現(xiàn)多種材料在空間上的精確分布,，比如金字塔模型所示的連續(xù)梯度材料的制備,，以及如魔方模型所示的多材料一體化打印。EFL研發(fā)的多材料DLP生物打印機（EFL-BP8601 Mix）為具有結(jié)構(gòu)復(fù)雜性的多材料模型制備提供了平臺,。在氣管狀模型,、肝小葉、手掌模型等器官結(jié)構(gòu)的仿生構(gòu)建中,，作者利用基于Rnps的多材料打印,，模擬了這些器官在結(jié)構(gòu)上的復(fù)雜性。為了體現(xiàn)該打印方式在藥物精確負(fù)載中的應(yīng)用，作者設(shè)計并構(gòu)建了具有“NKU”內(nèi)嵌復(fù)雜結(jié)構(gòu)的藥片以及一個多藥物集成負(fù)載的藥片模型,，以展現(xiàn)其載藥的便利性以及高通量,。此外，作者還通過打印不同種類的載細(xì)胞空心分叉管結(jié)構(gòu),，展示了基于Rnps的載細(xì)胞打印在可灌注血管樣組織制備中的應(yīng)用,。這些結(jié)構(gòu)的成功制備，進一步說明了基于Rnps的打印方法在多種生物醫(yī)學(xué)場景下的應(yīng)用潛力（圖6）,。   

圖6 Rnps在復(fù)雜結(jié)構(gòu)制造和多材料打印中的性能

全文總結(jié)         
本研究中開發(fā)了一種簡單而普適的蘆丁基光抑制劑——Rnps,，其通過同時進行光吸收過程和自由基反應(yīng)，能夠有效地減弱DLP 3D打印中光散射的影響,，提升打印保真度,。與Tar相比，含有Rnps的生物墨水打印速度提升至1.9倍,，層間過曝減少58%,，分辨率提高38.3%，高精度打印區(qū)間擴大至3倍,。使用這種光抑制劑制備的支架具有出色的細(xì)胞相容性以及出色的抗氧化活性,。Rnps能夠適用于各種生物墨水，是創(chuàng)建多材料和多功能生物醫(yī)學(xué)結(jié)構(gòu)的理想工具,。將Rnps集成到其他生物制造平臺中可能會為組織和器官的復(fù)雜體外重建提供更多技術(shù)支持,，從而加速其從理論模型到臨床轉(zhuǎn)化的發(fā)展進程。

南開大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院孔德領(lǐng)課題組碩士生李飛逸,，本科生李馨月,，博士生代殊昕為本文共同第一作者。該研究工作得到國家自然科學(xué)基金創(chuàng)新研究群體項目和青年項目,，以及博士后基金面上項目與物質(zhì)綠色創(chuàng)造與制造海河實驗室等項目的支持,。在這項研究中，應(yīng)用了EFL品牌的投影式光固化生物3D打印機（EFL-BP8601 Pro,、EFL-BP8601 Mix）,，和EFL品牌的多種光固化生物材料（EFL-GM、EFL-F127DA,、EFL-HAMA等）進行實驗,，感謝EFL對研究工作的鼎力支持。   


文章來源：

https://doi.org/10.1021/acsnano.4c05380