基于噴墨打印的可多次讀寫(xiě)“引物盤(pán)”DNA存儲(chǔ)系統(tǒng)

來(lái)源：生物打印與再生工程

DNA數(shù)據(jù)存儲(chǔ)是一種很有前途的信息存儲(chǔ)技術(shù)，它將信息編碼到堿基分子中，并且能夠在特定的存儲(chǔ)環(huán)境中長(zhǎng)久保存。DNA合成、測(cè)序可以將信息編碼到堿基序列并進(jìn)行讀取，使DNA存儲(chǔ)成為一種有潛力的數(shù)據(jù)存儲(chǔ)方案。然而，如何構(gòu)建易于刻錄、檢索和讀取的DNA數(shù)據(jù)仍然是一個(gè)挑戰(zhàn)。

清華大學(xué)機(jī)械系生物制造中心課題組開(kāi)發(fā)了一種新型的DNA存儲(chǔ)單元——“引物盤(pán)”（Primer Disk）,并建立了一套集追加寫(xiě)入、隨機(jī)訪(fǎng)問(wèn)、多次讀取、信息索引于一體的DNA信息存儲(chǔ)系統(tǒng)，為DNA存儲(chǔ)走向?qū)嶋H應(yīng)用提供了新的解決方案。該研究成果以“Primer-Disk-enabled DNA Data Storage System with Index and Record-Many-Read-Many Features”（基于引物盤(pán)的信息索引、追加寫(xiě)入、多次讀取功能的DNA數(shù)據(jù)存儲(chǔ)系統(tǒng)）為題，在線(xiàn)發(fā)表于《Advanced Science》（《先進(jìn)科學(xué)》）。

清華大學(xué)機(jī)械系歐陽(yáng)禮亮副教授、熊卓教授，清華大學(xué)深圳國(guó)際研究生院彌勝利教授為論文的通訊作者，2021級(jí)碩士生馬嘉翔為第一作者。

全球數(shù)據(jù)的年度規(guī)模持續(xù)增長(zhǎng)，預(yù)計(jì)到 2025 年將達(dá)到 175 ZB。然而，傳統(tǒng)存儲(chǔ)介質(zhì)如光盤(pán)和硬盤(pán)在信息密度方面已接近物理極限。利用分子存儲(chǔ)信息能夠突破這一限制，自然界利用 DNA堿基序列編碼和存儲(chǔ)了復(fù)雜的遺傳信息，從頭合成 DNA 技術(shù)的發(fā)展使得將任意信息存儲(chǔ)在DNA分子中成為可能，因此，以 DNA作為信息存儲(chǔ)的分子載體是最有前景的解決方案之一。總體而言，由于 DNA 數(shù)據(jù)存儲(chǔ)在存儲(chǔ)容量、長(zhǎng)期保存和低維護(hù)成本等方面的優(yōu)勢(shì)，其近年來(lái)獲得了極大關(guān)注。

DNA存儲(chǔ)領(lǐng)域在編碼/解碼、DNA合成/讀取、隨機(jī)訪(fǎng)問(wèn)、多次讀取等多個(gè)領(lǐng)域都取得了重大的進(jìn)展。目前的研究已經(jīng)可以實(shí)現(xiàn)將信息以較高的存儲(chǔ)密度編碼為DNA堿基序列，通過(guò)從頭合成的方式將信息存儲(chǔ)到DNA分子中，并通過(guò)測(cè)序分析的方式進(jìn)行讀取和解碼；基于DNA物理位置分離、PCR檢索、外部標(biāo)簽的方法已經(jīng)實(shí)現(xiàn)了存入DNA信息的隨機(jī)讀取；DNA固定、體內(nèi)存儲(chǔ)等方案也可以支持DNA信息的多次讀取。

盡管取得了一定的進(jìn)展，但DNA數(shù)據(jù)存儲(chǔ)走向?qū)嶋H應(yīng)用依然面臨巨大挑戰(zhàn)，其中瓶頸之一是DNA數(shù)據(jù)管理系統(tǒng)。例如，在傳統(tǒng)的存儲(chǔ)介質(zhì)中，往往存有文件的索引信息，以供信息的隨機(jī)訪(fǎng)問(wèn)；另外， 長(zhǎng)期的數(shù)據(jù)存檔往往需要對(duì)文件進(jìn)行版本控制、追加寫(xiě)入等操作。不同于傳統(tǒng)的存儲(chǔ)介質(zhì)，常規(guī)DNA存儲(chǔ)系統(tǒng)在進(jìn)行追加寫(xiě)入或重寫(xiě)等操作時(shí)操作麻煩，且難以隨機(jī)檢索，會(huì)造成大量的存儲(chǔ)空間和時(shí)間的浪費(fèi)。

在這一背景下， 清華大學(xué)機(jī)械系生物制造團(tuán)隊(duì)提出了一種創(chuàng)新的DNA數(shù)據(jù)存儲(chǔ)文件管理系統(tǒng)，采用“引物盤(pán)”（Primer Disk）作為新型的DNA存儲(chǔ)介質(zhì)。該系統(tǒng)實(shí)現(xiàn)數(shù)據(jù)的寫(xiě)入、追加寫(xiě)入、保存、多次讀取、索引等功能。

系統(tǒng)介紹
在本研究中，研究團(tuán)隊(duì)建立了一個(gè)具有索引和追加寫(xiě)入多次讀取（record-many-read-many，RMRM）特征的引物盤(pán)DNA數(shù)據(jù)存儲(chǔ)系統(tǒng)。該引物盤(pán)可以共價(jià)結(jié)合多種不同的寡核苷酸鏈并作為信息存儲(chǔ)的載體。DNA數(shù)據(jù)寫(xiě)入是通過(guò)將所需的DNA分子與引物盤(pán)上特定的互補(bǔ)引物結(jié)合并延伸，形成DNA文件來(lái)實(shí)現(xiàn)的。DNA分子與引物盤(pán)的結(jié)合不需要對(duì)DNA進(jìn)行額外的修飾，只需要常規(guī)的PCR。通過(guò)按需噴墨打印熒光分子和T4 DNA連接酶，將相應(yīng)的索引編碼存儲(chǔ)到引物盤(pán)的QR碼點(diǎn)陣列中（圖a）。熒光分子可以通過(guò)T4 DNA連接酶容易地與相應(yīng)的DNA分子末端結(jié)合。通過(guò)對(duì)不同的DNA分子和引物重復(fù)此過(guò)程，可以實(shí)現(xiàn)將不同的DNA文件和數(shù)據(jù)索引多次記錄到單個(gè)引物盤(pán)中（圖b）。在QR-code索引的指導(dǎo)下，通過(guò)原位固相PCR和隨后的測(cè)序復(fù)制足夠的DNA拷貝來(lái)實(shí)現(xiàn)DNA數(shù)據(jù)讀取（圖c）。當(dāng)需要讀取引物盤(pán)上的文件時(shí)，通過(guò)熒光掃描QR碼點(diǎn)陣獲得文件的索引信息，然后用相應(yīng)的引物原位擴(kuò)增DNA。對(duì)DNA進(jìn)行測(cè)序并解碼后，即可獲得數(shù)據(jù)。這種閱讀方法允許隨機(jī)和多次訪(fǎng)問(wèn)所需的特定數(shù)據(jù)，而不會(huì)丟失信息。總之，使用該策略，DNA數(shù)據(jù)可以追加寫(xiě)入、多次讀取和隨機(jī)訪(fǎng)問(wèn)。

圖1 基于引物盤(pán)的多次寫(xiě)入多次讀取的DNA信息存儲(chǔ)系統(tǒng)流程圖

實(shí)驗(yàn)結(jié)果
DNA在引物盤(pán)上的多次固定
首先，研究團(tuán)隊(duì)設(shè)計(jì)了引物盤(pán)。引物盤(pán)是通過(guò)將特定的引物共價(jià)連接到玻片上而形成的。為此，用對(duì)苯二異硫氰酸酯處理氨基修飾的載玻片，以在表面修飾異硫氰酸酯基團(tuán)。隨后將特定的氨基修飾的引物固定在異硫氰酸酯修飾的載玻片上，形成引物盤(pán)，并對(duì)其結(jié)合引物的密度、特異性結(jié)合的能力做出探索。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，DNA以2mM的濃度有效連接在盤(pán)片上，并具有極高的特異性（圖2a-c）。

隨后，團(tuán)隊(duì)在異硫氰酸酯載玻片和引物盤(pán)上多次固定DNA分子，模擬追加寫(xiě)入的過(guò)程。在盤(pán)片上固定DNA后，使用PCR原位復(fù)制DNA分子并進(jìn)行qPCR分析DNA的量（圖2d-e）。

qPCR數(shù)據(jù)顯示，異硫氰酸酯玻片上不能實(shí)現(xiàn)DNA的多次固定，而在引物盤(pán)上，DNA分子可以被穩(wěn)定多次固定，為后續(xù)DNA信息的多次寫(xiě)入奠定了基礎(chǔ)。

圖2 引物盤(pán)的構(gòu)建及DNA在引物盤(pán)上的多次固定

熒光點(diǎn)陣作為索引信息的多次寫(xiě)入
研究團(tuán)隊(duì)采用噴墨打印的方式將T4 DNA連接酶和熒光DNA分子以液滴點(diǎn)陣的方式打印到引物盤(pán)上，形成二維碼點(diǎn)陣作為索引。通過(guò)設(shè)計(jì)熒光DNA分子，團(tuán)隊(duì)實(shí)現(xiàn)了較高的連接效率（圖3a），并將其浸泡入94℃的水中驗(yàn)證其熱穩(wěn)定性，以確保其在PCR過(guò)程中的穩(wěn)定（圖3b）。
為了充分證明其可行性，研究團(tuán)隊(duì)在單個(gè)引物盤(pán)上寫(xiě)入了4個(gè)文件，并在每次寫(xiě)入后以噴墨打印的方式打印不同熒光DNA分子，以寫(xiě)入索引信息，使用共聚焦顯微鏡拍攝并拆分不同熒光點(diǎn)陣。結(jié)果表明，經(jīng)過(guò)4次寫(xiě)入后，二維碼索引點(diǎn)陣仍可分辨。這些結(jié)果表明，熒光DNA可以通過(guò)噴墨打印的方式，經(jīng)T4 DNA連接酶連接到引物盤(pán)上的DNA分子一端。

圖3 熒光點(diǎn)陣的噴墨打印和索引信息的多次寫(xiě)入

追加寫(xiě)入、多次讀取、隨機(jī)讀取
為了驗(yàn)證該存儲(chǔ)方案實(shí)際的追加寫(xiě)入、多次讀取、隨機(jī)讀取功能的可靠性，研究團(tuán)隊(duì)設(shè)計(jì)了標(biāo)準(zhǔn)的寫(xiě)入、讀取方案并與存儲(chǔ)在溶液中的DNA進(jìn)行多次讀取的比較。研究團(tuán)隊(duì)首先將4個(gè)文件依次寫(xiě)入到同一張引物盤(pán)中，并讀取20次（圖4a），并使用qPCR檢測(cè)每次讀取時(shí)提取的DNA的量（圖4b）。經(jīng)過(guò)12次的讀取過(guò)后，引物盤(pán)上的DNA數(shù)據(jù)沒(méi)有明顯的損失（~1%），而溶液中DNA信息的損失率高達(dá)80%（圖4c）。

圖4 信息的追加寫(xiě)入、多次讀取、隨機(jī)讀取

熒光點(diǎn)陣重新寫(xiě)入
另外，考慮到共聚焦顯微鏡使用光譜技術(shù)拆分不同的熒光信號(hào)，熒光點(diǎn)陣追加寫(xiě)入的數(shù)量將受限于熒光分子的種類(lèi)。因此，研究團(tuán)隊(duì)通過(guò)設(shè)計(jì)熒光DNA分子，使其可以通過(guò)限制性?xún)?nèi)切酶對(duì)熒光分子進(jìn)行切除，并通過(guò)噴墨打印T4 DNA連接酶和熒光DNA分子寫(xiě)入新的熒光點(diǎn)陣。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，經(jīng)過(guò)限制性?xún)?nèi)切酶的切除，平均熒光強(qiáng)度的變化具有極高的顯著性差異，限制性?xún)?nèi)切酶可以切除引物盤(pán)上的熒光分子（圖5a）。

隨后，研究團(tuán)隊(duì)測(cè)試了5個(gè)文件的寫(xiě)入，每次DNA信息寫(xiě)入后，打印熒光點(diǎn)陣，使用限制性?xún)?nèi)切酶擦除點(diǎn)陣，并進(jìn)行熒光點(diǎn)陣的拍攝。可以看出實(shí)際應(yīng)用中，擦除的過(guò)程不會(huì)影響再一次的寫(xiě)入（圖5c）。在5次寫(xiě)入過(guò)后，研究團(tuán)隊(duì)對(duì)DNA進(jìn)行測(cè)序，并通過(guò)DNA覆蓋率分析信息的損失，結(jié)果表明，經(jīng)過(guò)選擇的限制性?xún)?nèi)切酶不會(huì)對(duì)存入DNA的信息造成過(guò)大的影響（圖5d）。

圖5 熒光點(diǎn)陣的擦出與重新寫(xiě)入

總結(jié)與展望
本文設(shè)計(jì)并建立了一種基于引物盤(pán)的DNA數(shù)據(jù)存儲(chǔ)系統(tǒng)，以解決DNA數(shù)據(jù)存儲(chǔ)面向?qū)嶋H應(yīng)用的所面臨的挑戰(zhàn)，特別是DNA數(shù)據(jù)的追加寫(xiě)入和多次索引讀取。該方法使用引物盤(pán)實(shí)現(xiàn)了DNA信息的追加寫(xiě)入和多次讀取，通過(guò)噴墨打印技術(shù)結(jié)合T4 DNA連接酶實(shí)現(xiàn)了DNA數(shù)據(jù)存儲(chǔ)系統(tǒng)的隨機(jī)索引功能。

此外，引物盤(pán)DNA數(shù)據(jù)存儲(chǔ)系統(tǒng)涉及噴墨打印技術(shù)，并有可能在未來(lái)與原位合成步驟相結(jié)合，結(jié)合測(cè)序技術(shù)，該技術(shù)有望為端到端的DNA數(shù)據(jù)存儲(chǔ)系統(tǒng)的實(shí)現(xiàn)提供技術(shù)支撐。

參考文獻(xiàn)
J. Ma, Y. Yang, B. Pei, S. Mi, Z. Xiong, L. Ouyang, Primer-Disk-Enabled DNA Data Storage System with Index and Record-Many-Read-Many Features. Adv. Sci. 2025, e02367. https://doi.org/10.1002/advs.202502367

論文鏈接：
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