生物3D打印患者來源類器官陣列捕獲腫瘤內(nèi)在與外在特征助力精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)

來源：EFL生物3D打印與生物制造

當(dāng)前腫瘤研究中，傳統(tǒng)患者來源類器官（PDO）培養(yǎng)存在兩大核心問題：一是缺乏腫瘤微環(huán)境（TME）的模擬，如基質(zhì)硬度、缺氧條件等外在因素，導(dǎo)致無法準(zhǔn)確反映腫瘤病理特征；二是PDO尺寸和形態(tài)異質(zhì)性高，難以穩(wěn)定模擬患者個(gè)體間的生物學(xué)差異，限制了其在精準(zhǔn)醫(yī)療中的應(yīng)用。來自韓國蔚山科學(xué)技術(shù)院的Hyun-Wook Kang教授、Tae-Eun Park教授以及首爾大學(xué)的Seung-Jae Myung教授團(tuán)隊(duì)合作，開發(fā)了嵌入式生物打印技術(shù)構(gòu)建類器官陣列（Eba-PDOs）。該技術(shù)通過將PDO油墨精確打印到模擬腫瘤硬度（≈7.5 kPa）的海藻酸鹽浴中，形成統(tǒng)一尺寸的三維結(jié)構(gòu)，同時(shí)復(fù)現(xiàn)缺氧微環(huán)境。研究利用轉(zhuǎn)錄組分析和免疫熒光驗(yàn)證，證實(shí)Eba-PDOs能更精準(zhǔn)捕獲腫瘤內(nèi)在基因特征（如CEACAM5表達(dá)）和外在微環(huán)境響應(yīng)。相關(guān)工作以“Bioprinted Patient-Derived Organoid Arrays Capture Intrinsic and Extrinsic Tumor Features for Advanced Personalized Medicine”為題發(fā)表在《Advanced Science》上。     

研究內(nèi)容
1. 嵌入式生物打印構(gòu)建類器官陣列的流程與形態(tài)表征，通過定制化生物打印系統(tǒng)將含PDO細(xì)胞的Geltrex油墨擠壓至1.5%海藻酸鹽浴（模擬7.5 kPa基質(zhì)硬度），結(jié)合溫度和鈣離子雙重交聯(lián)，研究了Eba-PDOs的形成過程。結(jié)果表明，打印后7天形成直徑≈200 μm的均勻類器官，10天融合為統(tǒng)一結(jié)構(gòu)，細(xì)胞存活率超94%，其面積變異系數(shù)（0.18）顯著低于傳統(tǒng)培養(yǎng)的Std-PDOs（0.71），且不同患者來源的Eba-PDOs保留獨(dú)特形態(tài)特征。      

圖1. 嵌入式生物打印流程及Eba-PDOs形態(tài)對比（標(biāo)尺：1 mm（打印過程）、50 μm（組織染色）、500 μm（明場成像））。   

2. 類器官的腫瘤微環(huán)境模擬與病理特征分析，通過H&E染色、免疫熒光（YAP/TAZ、HIF1α、膠原I）和qPCR，對比Eba-PDOs與Std-PDOs的形態(tài)和分子表達(dá)。結(jié)果表明，Eba-PDOs核面積較Std-PDOs縮小1.7倍，機(jī)械應(yīng)力標(biāo)志物YAP1表達(dá)上調(diào)4倍，缺氧標(biāo)志物HIF1α和膠原I沉積顯著增加，且CDH2/CDH1比值升高（提示上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化），重現(xiàn)天然腫瘤的細(xì)胞擠壓、低氧環(huán)境和ECM重塑特征。      

圖2. Eba-PDOs的腫瘤病理特征表征（標(biāo)尺：100 μm（組織對比）、50 μm（免疫熒光））。   

3. 類器官與原發(fā)組織的轉(zhuǎn)錄組差異及功能富集，通過RNA測序和主成分分析（PCA），比較Std-PDOs、Eba-PDOs和患者原發(fā)組織的基因表達(dá)譜。結(jié)果表明，Eba-PDOs轉(zhuǎn)錄組與原發(fā)組織的Pearson相關(guān)系數(shù)（r=0.84）顯著高于Std-PDOs（r=0.48），差異表達(dá)基因（DEGs）富集于TNF信號、NF-κB炎癥通路及脂質(zhì)代謝過程，其中CEACAM5、KLF7等結(jié)直腸癌關(guān)鍵基因表達(dá)更貼近真實(shí)腫瘤。     

圖3. 轉(zhuǎn)錄組對比分析及功能富集（PCA、Pearson相關(guān)系數(shù)、KEGG通路）。   

4. 基質(zhì)硬度對CEACAM5表達(dá)與細(xì)胞極性的影響，通過設(shè)置不同濃度海藻酸鹽（0.5%-2%）調(diào)整基質(zhì)硬度，結(jié)合免疫熒光和流式細(xì)胞術(shù)，研究機(jī)械應(yīng)力對CEACAM5分布的調(diào)控。結(jié)果表明，1.5%海藻酸鹽（7.5 kPa）條件下，Eba-PDOs的CEACAM5表達(dá)水平與原發(fā)組織一致，且異常定位于細(xì)胞基底外側(cè)（模擬腫瘤細(xì)胞極性喪失），而軟基質(zhì)（0.5%海藻酸鹽）無法誘導(dǎo)該表型。      

圖4. 基質(zhì)硬度對CEACAM5表達(dá)模式的影響（標(biāo)尺：250 μm（免疫熒光））。   

5. 類器官陣列的患者異質(zhì)性與藥物響應(yīng)驗(yàn)證，通過培養(yǎng)5例患者的Eba-PDOs并進(jìn)行5-氟尿嘧啶（5-FU）藥物測試，分析CEACAM5水平與化療敏感性的關(guān)聯(lián)。結(jié)果表明，Eba-PDOs的CEACAM5表達(dá)與患者血清水平高度相關(guān)（r=0.84），高CEA組對5-FU的耐藥性顯著更強(qiáng)（AUC差異＞20%），而Std-PDOs未能區(qū)分該差異，驗(yàn)證了Eba-PDOs在預(yù)測個(gè)體藥物響應(yīng)中的價(jià)值。      

圖5. 患者間異質(zhì)性及藥物響應(yīng)分析（CEACAM5表達(dá)、細(xì)胞存活率曲線）。   

6. 基于形態(tài)學(xué)的無標(biāo)記預(yù)測模型構(gòu)建與驗(yàn)證，通過提取177個(gè)Eba-PDOs的亮度場圖像特征（面積、周長、圓度），訓(xùn)練隨機(jī)森林算法并結(jié)合多數(shù)投票法（MVA），建立高/低CEA分類模型。結(jié)果表明，使用50個(gè)Eba-PDOs時(shí)預(yù)測準(zhǔn)確率達(dá)98%，顯著優(yōu)于Std-PDOs（37%），且在7例新患者的外部驗(yàn)證中實(shí)現(xiàn)100%準(zhǔn)確分類。      

圖6. 無標(biāo)記形態(tài)學(xué)預(yù)測模型的構(gòu)建與性能驗(yàn)證（特征分布、混淆矩陣、預(yù)測準(zhǔn)確率）。

研究結(jié)論
本研究開發(fā)了嵌入式生物打印技術(shù)構(gòu)建的患者來源類器官陣列（Eba-PDOs），該模型通過模擬腫瘤微環(huán)境的基質(zhì)硬度（≈7.5 kPa）和缺氧條件，顯著提升了對原發(fā)腫瘤內(nèi)在特征（如CEACAM5表達(dá)異質(zhì)性）和外在響應(yīng)（如機(jī)械應(yīng)力信號通路激活）的模擬精度。研究表明，Eba-PDOs的轉(zhuǎn)錄組與原發(fā)組織的相關(guān)性（r=0.84）顯著高于傳統(tǒng)類器官（r=0.48），并能準(zhǔn)確捕獲患者間CEACAM5表達(dá)差異及其與5-氟尿嘧啶耐藥性的關(guān)聯(lián)。此外，基于Eba-PDOs形態(tài)特征開發(fā)的無標(biāo)記預(yù)測模型，通過多數(shù)投票法整合50個(gè)類器官數(shù)據(jù)，可實(shí)現(xiàn)98%的高/低CEA患者分類準(zhǔn)確率。本研究為精準(zhǔn)模擬腫瘤個(gè)體特征、預(yù)測藥物響應(yīng)提供了新平臺，有望推動個(gè)性化癌癥治療和藥物開發(fā)的臨床轉(zhuǎn)化。

文章來源：https://doi.org/10.1002/advs.202407871