南京大學(xué)鼓樓醫(yī)院關(guān)節(jié)外科史東泉：控制Kartogenin透明質(zhì)酸凝膠修復(fù)關(guān)節(jié)軟骨的研究

丁建東：非常感謝徐教授,！徐教授的每次報(bào)告,，總是既哲理又詩情畫意,。后面一個(gè)，本來是蔣青教授,，現(xiàn)在由史東泉教授來作。蔣教授是鼓樓醫(yī)院關(guān)節(jié)外科的主任,，史教授是副主任,。史教授國家優(yōu)秀青年基金獲得者，我相信他在一線也工作若干年,，肯定會有自己的見地,，下面歡迎史教授給我們作報(bào)告！

南京大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬鼓樓醫(yī)院關(guān)節(jié)外科副主任 史東泉的《控制Kartogenin透明質(zhì)酸凝膠修復(fù)關(guān)節(jié)軟骨的研究》

    史東泉：尊敬的戴院士,，謝謝主持人丁老師,！
    我們也瞎做了一些東西，但是未來也許可能不是白做的,，我覺得我們也在談一些轉(zhuǎn)化的事,。
    作為一個(gè)關(guān)節(jié)外科大夫，大家知道我們整天就知道換關(guān)節(jié)。其實(shí)我們平時(shí)也想砸砸自己的飯碗,，所以我們也想把軟骨修復(fù)修復(fù),。所以我們進(jìn)行了軟骨修復(fù)做了一些工作，跟大家匯報(bào)一下,。
    從臨床上來講,，軟骨實(shí)際上真的非常糟糕。我們做過大量的流調(diào),，就是在一個(gè)小區(qū)里面60歲里面,，問問他有沒有膝關(guān)節(jié)不舒服，60%以上的人都有這樣的體驗(yàn),，覺得我確實(shí)很久沒有蹲下去了,。這樣的問題,，最終主要的問題出現(xiàn)在軟骨上來,。很明顯的，這是我們在置換膝關(guān)節(jié),，但是白色軟骨四周都磨沒了,，我們可以看到他的軟骨下骨。但是我們想想國內(nèi)有將近八千萬的患者,，需要去塑造這樣的軟骨,。
    目前來講，其實(shí)從臨床上來講,，我們有很多的方法。我們可以看一下,，我們想做軟骨再生的時(shí)候,，我們發(fā)現(xiàn)這樣的病人有大量的有局灶性軟骨缺損，當(dāng)然還有一些年輕人的彌漫性的軟骨缺損�,，F(xiàn)在有很多問題,，包括種子細(xì)胞、一體化,、軟骨表型的問題,，始終沒有一個(gè)功能性的軟骨。上午很多老師講了他們的研究,，其實(shí)作為臨床大夫來講,，我們是希望策略越簡單越好，而不是說越復(fù)雜越好,，因?yàn)樵綇?fù)雜就越難開展,。
    我們每天早上7點(diǎn)點(diǎn)8點(diǎn)鐘都有討論，這樣的小分子有機(jī)化合物就是他們討論的東西。我們在2012年發(fā)現(xiàn),，這個(gè)小分子對骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞有明顯的向軟骨方向分化的作用,。對于我們做軟骨的人來講特別敏感，一聽到有這樣的軟骨有什么樣的作用,，我們會再繼續(xù)探索,。在2014年的時(shí)候，發(fā)現(xiàn)有人把小分子分開,，發(fā)現(xiàn)對滑膜關(guān)節(jié)的軟骨發(fā)育有很好的促進(jìn)作用,。我們再進(jìn)一步探究它的機(jī)制，發(fā)現(xiàn)這樣的小分子有機(jī)物跟我們軟骨相關(guān)的分子有強(qiáng)烈的相關(guān)性,。在這里,，我們就在想能不能建立緩釋組織工程支架體系，從而獲得與天然軟骨相接近的材料,？
    對于這樣的課題,，大家一起坐下來談，想要解決哪些問題,？第一個(gè),，我們作為古柯關(guān)節(jié)大夫來講，我們發(fā)現(xiàn)膝關(guān)節(jié)里面更多是滑膜,，滑膜里面用大量的間充質(zhì)干細(xì)胞,。既然告訴我們這樣的小分子有機(jī)物對骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞有成軟骨作用。那整個(gè)課題告訴,，滑膜類型的間充質(zhì)干細(xì)胞作為成軟骨種子細(xì)胞,，以骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞更有優(yōu)勢。而且很多臨床上的疾病,，當(dāng)時(shí)生出來這樣的組織,，跟軟骨有很相似的外形形狀。如果它對滑膜間充質(zhì)干細(xì)胞有成軟骨作用,，我們就去探索到底什么樣的濃度是最佳的,。如果我們找到這樣的濃度，那我們是不是拿到往關(guān)節(jié)內(nèi)去打,。如果關(guān)節(jié)內(nèi)打打,，我們發(fā)現(xiàn)能不能在臨床上盡量去運(yùn)用它？這一系列的關(guān)鍵問題,，就造成了這樣的課題,，我們希望通過我們的研究，把這樣的幾個(gè)關(guān)鍵問題解決掉,。
    于是我們開始了研究內(nèi)容的設(shè)計(jì),。我們希望把滑膜和間充質(zhì)干細(xì)胞分離出來,，我們希望它也有軟骨作用，進(jìn)一步想往天然軟骨方向轉(zhuǎn)化,。
    那么我們就開始了我們第一步,，我們把膝關(guān)節(jié)的滑膜取下來，取下來以后進(jìn)行培養(yǎng),。我們發(fā)現(xiàn)到8個(gè)月以后,，我們特別興奮地發(fā)現(xiàn)得到了這樣一個(gè)組織，我們只是做了一個(gè)離心的培養(yǎng),。當(dāng)時(shí),，我們看到這樣的組織以后挺興奮的，因?yàn)楦�我們手上看見的軟骨已�?jīng)漸漸相似了,。我們做了KGN,，我們發(fā)現(xiàn)這樣一個(gè)類軟骨的組織，我們發(fā)現(xiàn)在這個(gè)軟骨里面有大量類軟骨的細(xì)胞,，有組織的形成,。我們當(dāng)時(shí)就在想，這樣一個(gè)類軟骨組織到底是纖維軟骨還是透明軟骨,？因?yàn)樘烊魂P(guān)節(jié)內(nèi)是透明軟骨,。當(dāng)然如果我們經(jīng)常不去手術(shù)，慢慢它轉(zhuǎn)成纖維軟骨,。
    做軟骨都知道II型膠原是天然軟骨的關(guān)鍵,，所以我們就去做了這樣一個(gè)熒光，我們發(fā)現(xiàn)這樣一個(gè)類軟骨組織里面,，有大朗的II型膠原的表達(dá),。再比如我們的類天然的組織，很有可能跟天然透明軟骨相近,。于是我們又做了現(xiàn)到4個(gè)禮,，發(fā)現(xiàn)加入這個(gè)小分子有機(jī)物這個(gè)組里面的II型號膠原表達(dá)特別強(qiáng)烈。我們又檢測纖維軟骨透明性的表達(dá),，的時(shí)候，跟對照圖比有明顯的縮小,，但是沒有讓我們特別開心,、驚喜非常自信地的結(jié)果。這個(gè)小分子有機(jī)物是對于膝關(guān)節(jié)里面滑膜間充質(zhì)干細(xì)胞有軟骨方向的分化,。
    到這一步以后,，我們就想既然它有這樣的作用，那就往關(guān)節(jié)內(nèi)打打,。于是我們就設(shè)計(jì)了第二部分,，就是把這個(gè)小分子有機(jī)物往關(guān)節(jié)內(nèi)打打,，因此我們把在膝關(guān)節(jié)挖了一個(gè)洞，每個(gè)禮拜打一次,，連續(xù)打三個(gè)月,。到4個(gè)禮拜和12個(gè)禮拜的時(shí)候，我們?nèi)タ催@個(gè)兔子的組織,。我們發(fā)現(xiàn)到4個(gè)禮拜的時(shí)候,，雖然說跟對照圖比有明顯的縮小，但是沒有看到讓我們特別開心,、驚喜的結(jié)果,。但是到12個(gè)禮拜的時(shí)候，我們發(fā)現(xiàn)關(guān)節(jié)內(nèi)打小分子有機(jī)物的注射組,，明顯跟對照組比,，有很好的治療作用，填充非常完整,，邊緣相連,。我們知道其實(shí)作為軟骨修復(fù)來講，它不止是軟骨和軟骨下骨的一個(gè)緊密連接,，包括軟骨和周圍軟骨的緊密連接,，是一個(gè)三維一體化的過程。所以緊接著我們用了甲苯胺藍(lán)色,，我們發(fā)現(xiàn)4個(gè)禮拜的時(shí)候,，跟對照比好像小了一點(diǎn)點(diǎn)，但是到12周的時(shí)候,，發(fā)現(xiàn)我們在關(guān)節(jié)內(nèi)打的這樣一個(gè)控制它軟骨修復(fù)最糟糕的一組,，都比我們對照組要好很多。我們用番紅O染色去驗(yàn)證我們這樣的結(jié)果,，同樣地發(fā)現(xiàn),，我們治療組的最差的都比對照組最好的都要好很多。于是,，我們又去做了II型膠原免疫組化,，我們發(fā)現(xiàn)這樣的一個(gè)組織跟對照組比，顯然是有更多的II型膠原的表達(dá),。同時(shí)我們也檢測了I型膠原,，發(fā)現(xiàn)修復(fù)組織I型膠原的表達(dá)是很弱的。所以從這一步來講,，就是可以得出這樣的結(jié)論,，就是關(guān)節(jié)腔里打這樣的小分子有機(jī)物，是可以治療軟骨缺損,，我們也發(fā)表在arthritis research  therapy這樣的的雜志上,。
    其實(shí)這個(gè)過程還有很多的問題,，想要去做臨床轉(zhuǎn)化的，因?yàn)槲覀兌贾�道反�?fù)地這樣的注射,，對我們外科大夫來講是非常擔(dān)心的,，因?yàn)椴煌５刈⑸淙齻�(gè)月的話，非常容易感染,。而且我們關(guān)節(jié)內(nèi),，到底到我真正缺損的地方有多少有效的治療濃度？這也是有困惑的,。同時(shí),，如果對南京的病人來講，他一個(gè)禮拜來打一次,，打三個(gè)月,，可能他還可以接受。如果是哈爾濱或者是北京的話,，讓他每周來打一次,，顯然在臨床上是不可能推開的。
    于是我當(dāng)時(shí)考慮想在缺損的地方,，表面能夠有一個(gè)噴霧的東西,，噴到關(guān)節(jié)的表面，就變成一層固定的膜,。但是我當(dāng)時(shí)沒有參加過這樣的會,，如果有這么多老師知道我就好了。我跑到南大的高分子系,，跑到很多搞高分子的地方,。如果有一個(gè)東西，像噴霧噴到缺損的地方,，變成堅(jiān)硬的膜,，來兜住我自己的藥物的話，這是非常困難的,。因?yàn)橹挥羞@樣的一個(gè)操作過程,，才能可能在臨床上操作，我可以噴點(diǎn)霧噴到缺損的地方,，然后形成固體,，或者在體溫作用下變成固體，能夠兜住局部的藥物,，這才是可能轉(zhuǎn)化的。
    經(jīng)過一年多的尋找,，我才尋找到這樣的材料,。我跟我高中同學(xué)聊天,，聊聊我在做什么、我在做什么,，把我的困惑告訴他,。非常幸運(yùn)的是他正好做高分子，然后他說我?guī)湍闳ハ胂脒@個(gè)東西能不能去解決,，但是不一定是這種膜,。于是他就回去，我們也不停地在溝通交流,。于是回去以后他做了一個(gè)月告訴我,，他說我想了，可不可以用在臨床上,？他說我把你這個(gè)藥物包裹在液體里面,，然后打到你缺損的地方，我給你固化,，這樣局部的液體就不會跑,，而且能給你有效釋放，到底釋放能多少,？可能還需要我們一起討論,。于是他進(jìn)行了另一個(gè)實(shí)驗(yàn)，他發(fā)現(xiàn)HA照射了以后又變成了固體,。
    同時(shí),，我就四處找可以發(fā)紫外光的機(jī)器。后來好不容易在蘇州發(fā)現(xiàn)有這樣的發(fā)光器,，因?yàn)橹挥羞@樣的發(fā)光器,，才有可能在臨床上，我在膝關(guān)節(jié)打一個(gè)洞,，高溫消毒以后,，可以在關(guān)節(jié)內(nèi)使用。
    現(xiàn)在匯報(bào)的時(shí)候,，可以把幾秒鐘的東西過一下,，其實(shí)我們光這個(gè)紫外光發(fā)光的條件就用了三個(gè)月，就是到底在缺損的地方距離多遠(yuǎn),、發(fā)光的強(qiáng)度多少,、時(shí)間有多長，其實(shí)這是反復(fù)過程當(dāng)中,。一開始做的時(shí)候,，一發(fā)光就把軟骨燒紅了。所以在不斷摸索的過程中,，才找到了相對比較可靠的照射過程,。
    同時(shí),，他又幫我把它這個(gè)小分子有機(jī)物用納米包裹，他發(fā)現(xiàn)在體外顯示方兩個(gè)月,，基本上在這樣的包裹下問題不大,。如果前面兩部分的實(shí)驗(yàn)是非常可靠的話,，其實(shí)到了第三部分,，這樣的試驗(yàn)結(jié)果是我們很有信心，一定會比前面兩次更好,。所以我們到12周三個(gè)月的時(shí)候,，發(fā)現(xiàn)這樣的軟骨和天然軟骨幾乎沒有任何的差別。
    同時(shí),，我們做了各種染色,，包括甲苯胺，包括番紅染色的評分,，都跟天然的沒有太大的區(qū)別,。到了4個(gè)禮拜的時(shí)候，我們從番紅染色看,，還有幾個(gè)支架還在,，還沒有完全吸收。但是跟4個(gè)禮拜的對照圖比,，有明顯的很好的修復(fù)作用,。到12周的時(shí)候，我們特別開心,，因?yàn)槲覀儼l(fā)現(xiàn)這樣的修復(fù)組織周圍的液體基本上沒有了,，這樣的修復(fù)過程發(fā)現(xiàn)，跟周圍正常軟骨比,，發(fā)現(xiàn)跟它之間沒有任何的變化,。
    我們用番紅進(jìn)行染色，更讓我們興奮的是我們發(fā)現(xiàn)這樣的軟骨跟這樣的軟骨下骨的完全已經(jīng)緊密結(jié)合在一起,，沒有用分體的支架粘在一起,，完全是靠同一個(gè)支架在不同環(huán)境作用下進(jìn)行自己的軟骨生長。我們現(xiàn)在也投入很大的課題組,，專門想看為什么這樣一個(gè)交界的地方,，在周圍骨環(huán)境的情況下，跟周圍關(guān)節(jié)內(nèi)軟骨不同微環(huán)境下,，為什么骨,、軟骨能夠一體化長得這么好。
    我們進(jìn)行了II型膠原修復(fù)表達(dá)，我們發(fā)現(xiàn)這樣的修復(fù)組織的II型膠原表達(dá)甚至比周圍軟骨的II型膠原軟骨的表達(dá)更要好,，說明我們這樣一個(gè)修復(fù)組織是非常接近于類天然軟骨,。我們又去做I型膠原，就是說我們這樣的修復(fù)組織,，基本上不會是這樣的纖維軟骨的成分。
    我們隨機(jī)取了一些修復(fù)的軟骨條和正常的軟骨條,，我們送到北醫(yī)三院敖英芳進(jìn)行檢測生物醫(yī)學(xué),，無論是硬度方面，跟正常軟骨相比都沒有太大的區(qū)別,，說明我們這樣的修復(fù)軟骨是非常接近天然透明軟骨,。
    其實(shí)對于我們臨床大夫來講，想要在臨床上能夠推廣或者非常好地利用,，現(xiàn)在也是大家關(guān)心的,。因?yàn)槲覀冞@樣的技術(shù)，跟原來的軟骨細(xì)胞技術(shù)相比,，大家都知道原來的軟骨細(xì)胞要取正常的非修復(fù)性的軟骨進(jìn)行體外培養(yǎng)再植入體內(nèi),。這樣的兩步法，造成了這樣的軟骨細(xì)胞移植手術(shù)并不得到臨床大夫的非常認(rèn)可,，第一當(dāng)然是因?yàn)樗�的費(fèi)用非常貴,，就算它搞活動，打折下來也要5萬塊錢,。我們這樣成本,，只要2萬多塊錢能解決，從成本上得到很好的降低,。同時(shí),，我們不需要開放手術(shù)，只需要在關(guān)節(jié)下操作,，我們在打支架的時(shí)候,，可以把關(guān)節(jié)內(nèi)液體全部吸掉，暴露缺損的地方,，我們可以把這樣的支架注入到這樣的地方,。更重要的是，其實(shí)軟骨并不是大家想象中的規(guī)則的圓柱形,、立方體的,，所有的骨軟骨移植手術(shù)都需要破壞正常的軟骨。而我們這樣的情況下,，無論你損傷的軟骨是什么樣的形狀,，我們不關(guān)心，我們用這樣的液體支架植入你原來損傷的組織，而且我們根本不需要取任何軟骨細(xì)胞,，也不需要體外的干細(xì)胞,，完全利用體內(nèi)的滑膜間充質(zhì)干細(xì)胞，還有骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞進(jìn)行這樣的工作,。
    這樣的國家發(fā)明專利,，我們現(xiàn)在在談怎么樣在林場上進(jìn)一步推廣。我想用一個(gè)簡單的動畫給大家介紹一下我們這樣的技術(shù),，其實(shí)這樣的缺損是不規(guī)則的,，我們把它打進(jìn)去以后變成固體的支架，同時(shí)在局部釋放我們的藥物,，周圍各種種子細(xì)胞的歸巢,，最后修復(fù)。謝謝,！