3D打印纖連蛋白材料支架

來源：EngineeringForLife

纖連蛋白（Fn）是正常組織中含量最多的ECM蛋白,。Fn表達的上升與多種癌癥有關(guān)。例如在乳腺癌惡化的過程中,，纖維纖連蛋白（fFn）會促進腫瘤的生成和遷移,，一方面是因為惡性細胞中發(fā)生了上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）。除此以外,，F(xiàn)n含量上調(diào)被認定為是癌癥轉(zhuǎn)移壁龕形成前的重要一步,。Fn作為一種機械敏感性蛋白，當溶解在血漿中時總以比較緊湊聚集的狀態(tài)存在,，而當存在于ECM中時（例如fFn）則處于各種各樣的拉伸狀態(tài),。Fn的結(jié)構(gòu)則決定了影響其生物功能和細胞響應的結(jié)合位點是裸露還是隱蔽。Fn的原纖維生成需要通過力學遷移綁定在細胞表面受體上的整合素,，來解構(gòu)蛋白,。而從結(jié)構(gòu)角度來說，這一解構(gòu)過程大部分發(fā)生在I型位點（Fn-3）,，這一區(qū)域會暴露自締合位點來促成隨后的原纖維生成,。然而多年以來，人們依舊無法完全弄清Fn的I,II,III型位點是如何相互以及與細胞作用,，從而形成原纖維的,。除此以外,，如何生成穩(wěn)定有效的fFn纖維網(wǎng)絡也是一個難點。雖然之前有很多研究實現(xiàn)了無細胞的生成Fn網(wǎng)絡,，但是這些方法通常在應用到細胞培養(yǎng)和分析時,，往往缺乏以下四個特點：i)有效的細胞滲入和去除能力ii)足夠透明易于觀察iii)為細胞沉積基質(zhì)或者黏附提供一個支撐iv)足夠大面積的沒有合成材料的3D空間。

纖連蛋白（Fn）作為一種尤為重要的細胞外基質(zhì)（ECM）蛋白,，常常在2維或者3維的細胞培養(yǎng)系統(tǒng)中,，被用為涂層來創(chuàng)造一個能夠支持細胞存活的環(huán)境。但是,，這些蛋白涂層的涂覆方式都和體內(nèi)細胞沉積出來的用來組成ECM的Fn網(wǎng)絡的結(jié)構(gòu)和功能不一致,。近期，來自密西根大學的Joerg Lahann教授團隊在Advanced Materials雜志上發(fā)表了題為Engineered Fibrillar Fibronectin Networks as Three-Dimensional Tissue Scaffolds的文章,，報道了一種用網(wǎng)格狀聚合物支架支撐,，無細胞，力學性能好,，且尺度可控的3維纖維纖連蛋白（fFn）網(wǎng)絡,。作者通過在空氣，F(xiàn)n溶液和網(wǎng)格支架的3相交界處,，通過水動力誘導的方式,，可以形成十分穩(wěn)定的fFn網(wǎng)絡。該fFn網(wǎng)絡可以促進細胞的滲透和增殖,，并可體外擴增原代癌細胞,，誘導其間質(zhì)轉(zhuǎn)化。未來,，該人造fFn網(wǎng)絡有望應用于基礎細胞研究,，精準醫(yī)療，藥物測試和臨床前診斷,。

圖1. 水動力誘導Fn原纖維生成

作者利用支架輕微剪切Fn溶液（角速度8轉(zhuǎn)/分鐘）,，在空氣，F(xiàn)n溶液和支架三相接觸部位產(chǎn)生非溶液狀態(tài)的fFn網(wǎng)絡,，整個過程沒有使用變性劑（圖1）,。支架利用3D jet writing[2]方法打印PLGA獲得，帶有500x500um方形孔,，厚度120um,，可為細胞的滲透和生長提供更大體積的懸浮蛋白基質(zhì)。所制造出的fFn網(wǎng)絡與人類纖維母細胞沉積的基質(zhì)的形態(tài)類似,。

圖2. fFn網(wǎng)絡在老鼠乳腺癌模型中提升腫瘤移植效率

由于Fn為原發(fā)性乳腺癌細胞外基質(zhì)的主要成分,，作者測試了fFn網(wǎng)絡在老鼠乳腺癌模型中提升腫瘤移植效率的能力（圖2）。首先,，作者在支架上培養(yǎng)了AT-3小鼠乳腺癌細胞,，這種細胞會在fFn網(wǎng)絡上穩(wěn)定表達螢火蟲熒光素酶,。隨后，帶著30000細胞的fFn支架被植入免疫活性C57BL/6老鼠,。生物放光成像圖片顯示,，在支架中，初始的腫瘤生成信號在植入后兩天便出現(xiàn),。相反,，在細胞懸液中經(jīng)過21天也未曾出現(xiàn)腫瘤移植,。移植腫瘤的組織學圖片顯示,，癌細胞經(jīng)過fFn網(wǎng)絡侵入了周圍組織。增長的致瘤性與體外測試結(jié)果一致,，fFn網(wǎng)絡中的AT-3細胞增加了腫瘤初始亞群（CD29+/CD24+）和轉(zhuǎn)移（CD29+/CD24+/CD90.2+）,。

圖3. fFn網(wǎng)絡增加MDA-MB-468人類乳腺癌細胞的腫瘤初始細胞量

隨后，作者又測試了fFn網(wǎng)絡在人類三陰性乳腺癌細胞中是否也會增加致瘤性,。選用了MDA-MB-468細胞系列（圖3）,。四天的擴增之后，MDA-MB-468細胞形成了擴展面積達到10平方毫米的致密3D癌癥微環(huán)境,。與培養(yǎng)在組織培養(yǎng)聚苯乙烯（TCPS）上,，和Fn涂覆的TCPS上的細胞相比，fFn網(wǎng)絡上的CD44+/CD24−亞群顯著高于前兩者,。除此以外,，在所有時間點上，fFn網(wǎng)絡上的CD44+/CD24−/ALDH+亞群也是顯著高于控制組的,。MDA-MB-468細胞培養(yǎng)4天之后,，fFn網(wǎng)絡被去細胞化并且針對Fn和層連蛋白共染色。結(jié)果證明MDA-MB-468細胞只是分泌了少量的層連蛋白,，而原本的fFn網(wǎng)絡還是保存完好,。證明Fn是早期上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化的主要ECM因素。

圖4. fFn網(wǎng)絡擴增病人乳腺癌細胞

最后,，作者測試了利用fFn網(wǎng)絡直接擴增病人乳腺癌細胞的能力,，結(jié)果顯示8天的時候，fFn支架的擴增數(shù)量比對照組高出7倍,，且fFn支架可以在體外誘導乳腺癌病人細胞的上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化,。

圖5. 3D jet writing

文章中的網(wǎng)格狀聚合物支架由Joerg Lahann教授團隊之前提出的3D Jet Writing工藝制造，相關(guān)文章于2018年發(fā)表在Advanced Materials雜志上,，題為3D jet writing: functional microtissues based ontessellated scaffold architectures,。該工藝的優(yōu)勢在于可以3維高精度地沉積聚合物纖維，且不需要像溶體電紡那樣高溫加熱,，為載細胞的高精度電紡打印打下基礎,。其特點在于在打印噴頭的底部安裝了一個副電極,，抑制了纖維在沉積過程中的不穩(wěn)定，從而可以實現(xiàn)高重復精度的打印,。

參考文獻：
[1] Jordahl S, Solorio L, Neale D B, et al. Engineered Fibrillar Fibronectin Networks as Three‐Dimensional Tissue Scaffolds[J]. Advanced Materials, 2019, 31(46): 1904580.
[2] Jordahl J H, Solorio L, Sun H, et al. 3D jet writing: functional microtissues based on tessellated scaffold architectures[J]. Advanced Materials, 2018, 30(14): 1707196.