以“結(jié)構(gòu)-性質(zhì)-功能”視角分析生物墨水增強(qiáng)策略

來源： EngineeringForLife

水凝膠作為一種高含水的三維高分子網(wǎng)絡(luò)，其在結(jié)構(gòu)上模擬細(xì)胞外基質(zhì),，為細(xì)胞生長提供“支架”結(jié)構(gòu),，是生物3D打印常用的墨水材料。作為載體材料,，水凝膠的性質(zhì)決定了生物3D打印的成敗與質(zhì)量,，其需要具有良好的可打印性并能為細(xì)胞生長提供適宜微環(huán)境。然而,，普通水凝膠的交聯(lián)網(wǎng)不夠均勻且缺乏能量耗散機(jī)制使其機(jī)械性能較差,，無法成為兼顧可打印性及生物相容性的“好用”生物墨水。

近期,，美國德州農(nóng)工大學(xué)Akhilesh K. Gaharwar教授團(tuán)隊(duì)在Advanced Materials上發(fā)表綜述文章：Hydrogel BioinkReinforcement for Additive Manufacturing: A Focused Review of Emerging Strategies,。該文首先介紹生物墨水網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)如何影響其流變特性、機(jī)械強(qiáng)度以及生物學(xué)特性,，接著重點(diǎn)綜述現(xiàn)有生物墨水增強(qiáng)機(jī)理及其對生物墨水關(guān)鍵性能的影響,，最后給出了幾種有前景的下一代生物墨水設(shè)計(jì)方法。該綜述通過深入分析生物墨水“結(jié)構(gòu)-性質(zhì)-功能”的關(guān)系來指導(dǎo)墨水設(shè)計(jì),，這種自下而上的視角為生物3D打印提供了以材料為中心的生物墨水設(shè)計(jì)思路,。

一、生物墨水的基本特性
首先需要探討生物墨水的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu),、流變特性,、生物力學(xué)和生化特性。這些特性以復(fù)雜的方式相互關(guān)聯(lián),，在優(yōu)化生物墨水性能時(shí)必須予以考慮,。隨著研究深入，這些領(lǐng)域中某些因素已被認(rèn)為對生物墨水性能至關(guān)重要（例如剪切稀化和彈性模量）,，一些因素仍在評估中（例如剪切恢復(fù)和應(yīng)力松弛）,。盡管這些因素在文獻(xiàn)中并未得到一致報(bào)道，但在物墨水設(shè)計(jì)時(shí)仍應(yīng)重點(diǎn)研究,。

圖1 生物墨水的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu),、流變特性、生物力學(xué)及生化特性在打印中的相互作用

1. 生物墨水的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)
（1）交聯(lián)網(wǎng)絡(luò)
經(jīng)典的聚合物三維網(wǎng)絡(luò)通過兩種方式形成：a單體溶液的聚合和交聯(lián),；b現(xiàn)有聚合物交聯(lián),。兩種方法通常都包含密集和稀疏交聯(lián)區(qū)域的隨機(jī)分布，這種異質(zhì)性導(dǎo)致受力時(shí)局部應(yīng)力集中,，從而在聚合物網(wǎng)絡(luò)中形成較弱的破壞區(qū)域,。因此，交聯(lián)點(diǎn)分布是決定聚合物網(wǎng)絡(luò)機(jī)械性能的關(guān)鍵,。交聯(lián)度增加意味著異構(gòu)網(wǎng)絡(luò)變多,，這使水凝膠變硬,、變脆，而低交聯(lián)度水凝膠表現(xiàn)為軟,、韌,。
（2）斷裂與能量耗散
當(dāng)前的生物墨水文獻(xiàn)通常僅通過一些機(jī)械參數(shù)來表征凝膠，例如斷裂應(yīng)變,、應(yīng)力以及壓縮,、拉伸或剪切模量。這些參數(shù)固然重要,，但僅部分描述了水凝膠的機(jī)械性能,。對于比較聚合物網(wǎng)絡(luò)中的總體機(jī)械性能，特別有用的參數(shù)是斷裂能,。

水凝膠與其他柔軟的聚合物網(wǎng)絡(luò)具有許多結(jié)構(gòu)相似性,，但它們的水合結(jié)構(gòu)導(dǎo)致其機(jī)械性能在關(guān)鍵方面有所不同。在所有的軟聚合物網(wǎng)絡(luò)中,，固有斷裂能取決于裂縫平面處聚合物鏈的長度,、數(shù)量和鍵強(qiáng)度。交聯(lián)可增加彈性模量和拉伸強(qiáng)度,，但會(huì)降低斷裂能和可延展性,。這些因素一起嚴(yán)重限制了常規(guī)水凝膠的機(jī)械性能。


2. 生物墨水的流變特性和流動(dòng)模型
（1）牛頓模型
通常在牛頓流體模型中對在打印條件范圍內(nèi)保持一致黏度的生物墨水進(jìn)行建模,，其中剪切速率（γ）等于剪切應(yīng)力（τ）除以黏度（K）,。但是，大多數(shù)用于擠出3D打印的生物墨水都是非牛頓流體,，它們的表觀黏度取決于剪切速率或變形歷史,。非牛頓效應(yīng)通常是由于長聚合物鏈的重新取向和靜電相互作用的破壞而引起，這是增強(qiáng)型生物墨水的常見特征,。

（2）冪模型
在剪切稀化的生物墨水中,，增加剪切速率會(huì)迫使聚合物鏈沿流向?qū)�齊，從而降低表觀黏度,。在較高剪切速率下靜電相互作用的破壞也降低了表觀黏度,。剪切稀化特性對生物打印有益，因?yàn)榇蛴∵^程中剪切應(yīng)力較低,，降低了對細(xì)胞的損傷,。
模擬剪切稀化行為的最簡單方法是利用冪律關(guān)系（圖1），其中剪切應(yīng)力（τ）與剪切速率（γ）通過流動(dòng)行為指數(shù)（n）和稠度指數(shù)（K）得出,。在該模型中,，牛頓流體的n = 1,，而n值<1則將呈現(xiàn)剪切稀化,。冪模型對于在打印條件下的許多生物墨水非常有用,。

（3）Herschel Bulkley模型
許多非牛頓生物墨水還表現(xiàn)出黏彈性，其特點(diǎn)是存在一個(gè)屈服應(yīng)力,。屈服應(yīng)力是引發(fā)流動(dòng)所需的最小應(yīng)力,。打印的保真度受屈服應(yīng)力影響�,？梢酝ㄟ^在流動(dòng)輪廓的中心產(chǎn)生活塞流,，從而在擠出過程中使包封的細(xì)胞免受剪切力的影響，此時(shí)剪切力被限制在沿?cái)D出機(jī)壁的狹窄區(qū)域內(nèi),。

高屈服應(yīng)力使生物墨水難以使用,，不利于移液和細(xì)胞分散操作。屈服應(yīng)力的變化已在一系列生物墨水中被注意到,，其可改善生物墨水的可打印性和細(xì)胞存活率,。Herschel-Bulkley模型中τ0為屈服應(yīng)力，低于此值,，生物墨水將表現(xiàn)為固體,。Herschel-Bulkley流體模型可以準(zhǔn)確地描述出剪切稀化和屈服應(yīng)力的非牛頓流體行為。

（4）Carreau方程
可以使用更復(fù)雜的模型來表征生物墨水的行為,，如Carreau方程,，該方程對于描述非常低和高剪切速率下生物墨水的不同流動(dòng)行為特別有用。當(dāng)剪切速率太低而無法克服聚合物鏈的隨機(jī)運(yùn)動(dòng)方向時(shí),，流體被視為具有恒定黏度的牛頓流體,，而在中等剪切速率下則被視為冪流體。在較高的剪切速率下,，它們再次變?yōu)榕ｎD流體,。該模型最近用于表征聚丙交酯微纖維增強(qiáng)藻酸鹽生物墨水的流動(dòng)行為。

（5）現(xiàn)有模型局限性
盡管現(xiàn)有的流動(dòng)模型可以幫助預(yù)測打印過程中的生物墨水行為,，但擠出后的剪切恢復(fù)變得很重要,，但在這些模型中并未考慮在內(nèi)。

當(dāng)前的流動(dòng)模型對于結(jié)合實(shí)際實(shí)驗(yàn)篩選潛在的生物墨水非常有用,。最新研究表明,，剪切稀化、屈服應(yīng)力和快速剪切恢復(fù)是生物墨水可打印性的關(guān)鍵因素,。

3. 生物墨水的生物力學(xué)特性
（1）宏觀尺度
宏觀上,，生物3D打印的最終目標(biāo)是植入人體，這使多數(shù)生物墨水難以達(dá)到相匹配的械性性能,，包括剛度,、黏彈性和屈服應(yīng)力/應(yīng)變。例如,，軟組織植入物需要維持與周圍組織相似的壓縮水平,，而不會(huì)被破壞或與周圍組織分離,。在生物打印中，水凝膠在擠出后還必須能夠支撐自身,，而不會(huì)出現(xiàn)明顯的塌陷或變形,。

（2）細(xì)胞尺度
除了宏觀尺度，細(xì)胞感知尺度的機(jī)械性能在組織再生中也起著重要作用,。彈性模量（或剛度）會(huì)深刻影響封裝細(xì)胞的行為,，例如，間充質(zhì)干細(xì)胞（MSC）的基質(zhì)剛度依賴性分化,。此外,，更復(fù)雜的黏彈性能也顯著引導(dǎo)細(xì)胞行為。例如,，與純彈性水凝膠相比,，顯示出應(yīng)力松弛的黏彈性水凝膠即使較軟也能促進(jìn)成肌細(xì)胞增殖�,？焖俚膽�(yīng)力松弛會(huì)增加MSC的增殖,、擴(kuò)散和成骨分化。


4. 生物墨水的生理穩(wěn)定性和生化相互作用
水凝膠的生化環(huán)境涉及生物力學(xué)性能,。例如,，細(xì)胞可以通過整合素蛋白感知基質(zhì)的剛度，因此沒有整合素結(jié)合位點(diǎn)的水凝膠會(huì)減少細(xì)胞對基質(zhì)剛度的反應(yīng),。另外,，生物降解性是水凝膠設(shè)計(jì)中的重要因素。水凝膠將隨著時(shí)間的推移被再生組織取代,，其降解速率應(yīng)與組織再生速率相匹配,。

二、現(xiàn)有生物墨水增強(qiáng)策略
早期3D打印水凝膠只是在機(jī)械性能和細(xì)胞相容性之間折衷,。隨著生物3D打印技術(shù)的發(fā)展,，已出現(xiàn)了許多增強(qiáng)型生物墨水材料。他們采用了例如聚合物功能化,、超分子增強(qiáng),、納米復(fù)合材料等增強(qiáng)等方式。這些方法通過多種不同渠道改善了水凝膠的機(jī)械性能,，包括加強(qiáng)交聯(lián),、使應(yīng)力分布均勻以及通過犧牲鍵耗散機(jī)械能等。

圖2 水凝膠生物墨水增強(qiáng)方式

1. 聚合物功能化及雙交聯(lián)網(wǎng)絡(luò)
（1）甲基丙烯酸酯功能化
作為最廣泛使用的方法之一,，甲基丙烯酸酯基團(tuán)修飾聚合物在其主鏈上引入雙鍵,，這使聚合物可在光引發(fā)劑存在下進(jìn)行光交聯(lián)。例如，常用的甲基丙烯�,；�明膠（GelMA）在維持明膠許多基本生物活性及溫敏性的同時(shí)賦予其光交聯(lián)性,。光交聯(lián)的GelMA在體溫下穩(wěn)定，具有較高的斷裂能,，更耐降解，并且可以通過選擇性曝光進(jìn)行圖案化,，用于光固化3D打印,。甲基丙烯酸酯化也已應(yīng)用于多糖，包括透明質(zhì)酸,、殼聚糖,、葡聚糖等。

（2）點(diǎn)擊化學(xué)及其他方法
點(diǎn)擊化學(xué)反應(yīng)有高活性并且可在溫和的條件下進(jìn)行的特點(diǎn),。其中最常見的為硫醇-雙鍵點(diǎn)擊化學(xué)反應(yīng),。硫醇-雙鍵點(diǎn)擊反應(yīng)為逐步增長反應(yīng)，其不受氧的抑制且速率很高,。這種快速交聯(lián)特性可通過在擠出的幾秒鐘之內(nèi)固化生物墨水來改善可打印性,，從而減少結(jié)構(gòu)下垂。

此外,，還有用于生物墨水的非光交聯(lián)劑,。例如，酪氨酸酶已被用作光引發(fā)劑的替代物,，以催化膠原和明膠的交聯(lián)來增強(qiáng)生物墨水,。

2.超分子生物墨水

圖3 超分子作用生物墨水機(jī)理

（1）主-客體作用
主-客體作用是一種可逆的動(dòng)態(tài)鍵合方式，最常見的便是β-環(huán)糊精與金剛烷間的特異性結(jié)合,�,；�于��-客體作用的水凝膠具有剪切稀化及自愈合性能，這有利于擠出打印,。盡管主-客作用具有特殊性質(zhì),，但是水會(huì)削弱主-客體間結(jié)合力，隨著時(shí)間的流逝,，超分子部分容易受到蠕變和侵蝕的影響,。此外，主-客體作用制備的凝膠往往機(jī)械性能較差,，因此它經(jīng)常與共價(jià)鍵交聯(lián)結(jié)合使用,。

（2）超分子作用
其他類型的超分子作用如氫鍵、π-π堆積,、多肽及DNA類型的超分子水凝膠等,。這些類型超分子作用由于其制備過程復(fù)雜或機(jī)械性能較難滿足3D打印需求因而研究較少。

3. 互穿網(wǎng)絡(luò)
互穿網(wǎng)絡(luò)（IPN）通過高度異質(zhì)的水凝膠結(jié)構(gòu)提高了斷裂能、韌性和剛度,。IPN由兩個(gè)單獨(dú)的聚合物網(wǎng)絡(luò)組成,，這些聚合物網(wǎng)絡(luò)通過共價(jià)或離子交聯(lián)結(jié)合在一起（圖 4）。

圖4 基于互穿網(wǎng)絡(luò)的生物墨水原理圖

（1）離子-共價(jià)鍵糾纏網(wǎng)絡(luò)
在生物墨水中,，最有常見IPN是通過離子-共價(jià)鍵糾纏（ICE）形成的,。對于生物打印應(yīng)用而言，傳統(tǒng)的共價(jià)鍵雙網(wǎng)絡(luò)水凝膠制備時(shí)間過長,。ICE水凝膠由離子交聯(lián)的剛性聚合物和共價(jià)交聯(lián)的彈性聚合物形成,。使用兩種不同的交聯(lián)機(jī)制大大減少了形成IPN所需的時(shí)間。

（2）雙重網(wǎng)絡(luò)
雙重網(wǎng)絡(luò)為兩個(gè)相互獨(dú)立的交聯(lián)網(wǎng)絡(luò),，一般為兩個(gè)網(wǎng)絡(luò)使用不同交聯(lián)方式,，相互之間的交聯(lián)不干擾。與任一單獨(dú)組分網(wǎng)絡(luò)相比,，雙網(wǎng)絡(luò)凝膠的機(jī)械性能表現(xiàn)的更為優(yōu)秀,。

互穿網(wǎng)絡(luò)通過使用脆性犧牲網(wǎng)絡(luò)與可擴(kuò)展第二網(wǎng)絡(luò)相結(jié)合，在較寬的損壞區(qū)域內(nèi)分配應(yīng)力來提高機(jī)械性能,。由于其交聯(lián)快速及可恢復(fù)的機(jī)械性能而被用于生物打印,。物理交聯(lián)聚合物通常也是黏度調(diào)節(jié)劑，同時(shí)改善了可打印性,。


4. 納米復(fù)合

圖5 納米復(fù)合增強(qiáng)水凝膠生物墨水

由于納米材料的高比表面積,，即使用量很少也可以顯著影響水凝膠網(wǎng)絡(luò)的性能。納米材料的摻入已被用來向生物墨水添加新的功能,，例如增強(qiáng)電導(dǎo)率,、刺激響應(yīng)能力、對細(xì)胞行為的控制,、改善打印性和機(jī)械性,。

常用的納米材料有石墨、碳納米管,、納米粘土,、磁性納米顆粒、過渡金屬二硫?qū)倩�物和聚合物納米顆粒等,。增強(qiáng)機(jī)制可能會(huì)根據(jù)納米粒子的大小,、形狀和表面化學(xué)性質(zhì)而有所不同。通常認(rèn)為納米顆粒是通過充當(dāng)跨越多個(gè)聚合物鏈的可逆交聯(lián)劑而增強(qiáng)水凝膠的,。這樣可以使應(yīng)力有效地分散到整個(gè)網(wǎng)絡(luò)中,，并通過破壞納米粒子與聚合物間的交聯(lián)而耗散能量。應(yīng)力分散避免了大范圍的裂紋擴(kuò)展,，這種機(jī)理已被證明可以提高水凝膠的強(qiáng)度和韌性,。

三,、下一代生物墨水增強(qiáng)策略

圖6 水凝膠生物墨水增強(qiáng)的前沿技術(shù)

1. 多組分生物墨水
顧名思義，將多種交聯(lián),、增強(qiáng)方式組合使用,，進(jìn)而獲得具有特殊性能的生物墨水。盡管各種增強(qiáng)方式實(shí)現(xiàn)過程不同,，但是這些增強(qiáng)策略背后的機(jī)制并不是相互排斥的,，往往可以與其他方法結(jié)合使用。組合使用后可以彌補(bǔ)各自缺點(diǎn)并整合不同增強(qiáng)機(jī)制的優(yōu)勢,。


2. 滑動(dòng)環(huán)交聯(lián)生物墨水
單網(wǎng)絡(luò)水凝膠的弱點(diǎn)之一是非均一的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu),，這導(dǎo)致應(yīng)力集中在最短的鏈上。使用機(jī)械互鎖的分子,，包括滑動(dòng)環(huán)交聯(lián)體系,，如聚輪烷等可有效避免應(yīng)力集中,。這些環(huán)動(dòng)態(tài)地跨鏈滑動(dòng),，在交聯(lián)點(diǎn)間均勻地分配應(yīng)力，從而使水凝膠具有出色的可延展性和高斷裂強(qiáng)度,。


3. 基于微凝膠的生物墨水
基于水凝膠微球的生物生物墨水格外引人注目,。水凝膠微球密集堆積或填充于液體中，微球間的接觸面可發(fā)生交聯(lián)反應(yīng)進(jìn)而形成大塊凝膠,。這種方法可控制孔隙率,，從而創(chuàng)建高度互連的微孔支架，同時(shí)還可為細(xì)胞提供特殊的微環(huán)境,。微球還可包載不同細(xì)胞,，進(jìn)而構(gòu)建多細(xì)胞支架。然而,，微球可打印性的影響因素仍然知之甚少,。包括微球尺寸、多分散性,、堆積密度,、表面相互作用等。

總結(jié)
水凝膠生物墨水的生物學(xué)活性與機(jī)械性能通常比較矛盾,。細(xì)胞的生長往往需要稀疏的交聯(lián)網(wǎng)絡(luò)以便養(yǎng)分傳輸,，而強(qiáng)度和可打印性則需要更高的聚合物濃度。這些矛盾的需求推動(dòng)了對更高級水凝膠結(jié)構(gòu)的研究,。常規(guī)的單網(wǎng)絡(luò)水凝膠因其不均勻的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)而引起的應(yīng)力集中,，這削弱了凝膠的強(qiáng)度。將機(jī)能量耗散機(jī)制整合到水凝膠結(jié)構(gòu)中可顯著提升凝膠機(jī)械性能,。

隨著細(xì)胞行為與材料間相互作用的研究,，生物墨水增強(qiáng)技術(shù)愈發(fā)重要,。多種組合技術(shù)可能具有協(xié)同作用，微球生物打印和滑環(huán)交聯(lián)等新方法也正在被積極研究,。

參考文獻(xiàn)：
[1] Chimene D, Kaunas R, Gaharwar AK. Hydrogel Bioink Reinforcementfor Additive Manufacturing: A Focused Review of Emerging Strategies [J]., 2020,32(1): 1902026.