清華大學(xué)孫偉團(tuán)隊(duì)3D打印出可進(jìn)行刺激性反應(yīng)的神經(jīng)回路

2020年6月23日,，南極熊獲悉，清華大學(xué)孫偉教授團(tuán)隊(duì)3D打印出了能夠培育神經(jīng)細(xì)胞的大腦類(lèi)組織結(jié)構(gòu),。他們從大鼠的皮層中提取了一組初級(jí)神經(jīng)細(xì)胞,，并將其整合到打印的結(jié)構(gòu)中，然后測(cè)試了所制造的結(jié)構(gòu),。有趣的是,，經(jīng)過(guò)數(shù)周的體外培育，初級(jí)神經(jīng)細(xì)胞已經(jīng)形成了一個(gè)復(fù)雜的神經(jīng)回路,，能夠?qū)ν饨绱碳ぷ龀龇磻?yīng),。

這項(xiàng)研究結(jié)果已經(jīng)發(fā)表在論文 "Engineering of brain-like tissue constructs via 3D Cell-printing technology "中。該論文由Yu Song, Xiaolei Su, Kevin F. Firouzian, Yongcong Fang, Ting Zhang, and Wei Sun共同撰寫(xiě)。

△提取神經(jīng)細(xì)胞進(jìn)行生物打印,，圖片來(lái)自清華大學(xué),。

一個(gè)活的3D模型

3D生物打印技術(shù)雖然先進(jìn)，但還不能制造有用的完整器官,。幸運(yùn)的是,，較小和不太復(fù)雜的組織結(jié)構(gòu)在健康監(jiān)測(cè)和藥物測(cè)試方面有其用途。例如,，醫(yī)學(xué)專(zhuān)業(yè)人員能夠從個(gè)人身上收集神經(jīng)細(xì)胞,，并將其在3D打印的網(wǎng)格狀結(jié)構(gòu)上生長(zhǎng)成較大的培養(yǎng)物。這些3D結(jié)構(gòu)很好地模仿了真實(shí)腦組織中的通路,，因此神經(jīng)細(xì)胞把它們當(dāng)成了真實(shí)腦組織,，并在適當(dāng)?shù)臓I(yíng)養(yǎng)下，沿著它們生長(zhǎng),。

由此產(chǎn)生的神經(jīng)回路的行為就像一個(gè)微型大腦一樣,。一旦復(fù)雜到足以對(duì)刺激做出反應(yīng)，就將培養(yǎng)物暴露在實(shí)驗(yàn)藥物中,，并記錄它們的神經(jīng)反應(yīng),，讓我們了解如果人類(lèi)試用藥物，實(shí)際的大腦可能會(huì)做出怎樣的反應(yīng),。

△3D打印的類(lèi)腦組織,，照片來(lái)自清華大學(xué)

生物打印大腦

研究人員必須經(jīng)過(guò)幾個(gè)階段的試錯(cuò)，才能得到正確的結(jié)構(gòu),。他們發(fā)現(xiàn)最佳的噴嘴直徑和打印速率分別為0.51毫米和5μL/s,。所得結(jié)構(gòu)的彈性模量約為6千帕，并采用免疫染色成像技術(shù)跟蹤打印結(jié)構(gòu)上神經(jīng)細(xì)胞的生長(zhǎng)情況,。

為了測(cè)試神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)的電刺激反應(yīng),，該團(tuán)隊(duì)直接在4×4電極陣列中培養(yǎng)它們。產(chǎn)生電場(chǎng)并觀察神經(jīng)元,，顯示出敏感的活動(dòng)。然后用河豚毒素來(lái)測(cè)試培養(yǎng)物的藥物敏感性,，表明3D打印結(jié)構(gòu) "作為藥物測(cè)試模型的潛力巨大",。

最后，研究了2D和3D結(jié)構(gòu)打印時(shí)神經(jīng)細(xì)胞的存活率,。3D結(jié)構(gòu)可以保持整整4周的活力,，最初85%的細(xì)胞在生物打印過(guò)程中存活下來(lái)。相比之下,，2D結(jié)構(gòu)的存活率只有25%,，驗(yàn)證了清華科學(xué)家3D生物打印腦組織方法的優(yōu)越性。

△用電極陣列測(cè)試2D和3D形態(tài)，圖片來(lái)自清華大學(xué)

孫偉教授及其近期生物3D打印科研成果

生物3D打印作為生物制造的核心技術(shù),，其運(yùn)用細(xì)胞,、蛋白質(zhì)、生物材料等作為構(gòu)造單元,，以構(gòu)建生物學(xué)模型,、生命系統(tǒng)和治療產(chǎn)品。孫偉從構(gòu)造單元層面上提出了生物3D打印的五個(gè)階段：

第一個(gè)階段是無(wú)生物相容性材料的打印,，如樹(shù)脂,、塑料等，主要用于外科手術(shù)設(shè)計(jì)模型或是牙科手術(shù)規(guī)劃,；

第二個(gè)階段是打印具有生物相容性但不能降解的材料,，如金屬，主要用于不可降解的假肢移植物,；

第三個(gè)階段是打印具有生物相容性可降解的材料,，如可降解的高分子材料，例如骨組織工程支架,、人造皮膚修復(fù)體以及心臟支架等,；

第四個(gè)階段是打印活性細(xì)胞，這類(lèi)材料可以用來(lái)構(gòu)建體外生物學(xué)模型,、藥理/病理模型,、器官芯片等；

第五個(gè)階段是打印類(lèi)器官,，如人工的生命系統(tǒng),、微型生理系統(tǒng)、細(xì)胞機(jī)器人等

生物3D打印的五個(gè)階段

今年4月份,，清華大學(xué)深圳國(guó)際研究生院彌勝利與孫偉教授課題組在知名學(xué)術(shù)雜志Nature Communications發(fā)表題為Fiber reinforced GelMA hydrogel to induce the regeneration of corneal stroma的文章,，利用生物3D打印技術(shù)，制備纖維水凝膠復(fù)合支架,，在角膜基質(zhì)的誘導(dǎo)再生領(lǐng)域取得重大進(jìn)展,。

如何制備能夠模擬天然角膜基質(zhì)結(jié)構(gòu)的支架，同時(shí)保持角膜基質(zhì)細(xì)胞的表型,，誘導(dǎo)角膜基質(zhì)的再生,，是一個(gè)重大的挑戰(zhàn)。

生物3D打印角膜支架
針對(duì)這一難題,，清華大學(xué)彌勝利與孫偉教授課題組提出了使用近場(chǎng)靜電紡絲這一生物3D打印技術(shù)制備網(wǎng)格狀的亞微米纖維支架,，后期通過(guò)水凝膠技術(shù)，制備了纖維水凝膠復(fù)合支架,，用于模擬正交定向的角膜基質(zhì)板層結(jié)構(gòu)和板層之間起連接作用的糖蛋白,。并提出了一種最優(yōu)的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)及化學(xué)因子的組合,，可以抑制角膜基質(zhì)細(xì)胞的成纖維分化，保持其表型,，并最終實(shí)現(xiàn)角膜基質(zhì)的誘導(dǎo)再生,。

角膜支架的材料

目前近場(chǎng)靜電紡絲技術(shù)應(yīng)用最廣泛的材料是PCL，但是由于PCL是疏水材料,，不利于細(xì)胞的粘附,。因此該研究利用PEG作為引發(fā)劑，合成了PEG和PCL的共聚物PECL,，顯著的提高了PCL的親水性,。并首次利用近場(chǎng)靜電紡絲技術(shù)成功的制備了正交定向的PECL亞微米纖維支架，角膜緣基質(zhì)干細(xì)胞可以在支架表面黏附并沿著纖維方向鋪展及生長(zhǎng),。

研究通過(guò)將MA修飾到明膠大分子鏈上合成了GelMA,，探究出最優(yōu)的MA修飾度及GelMA濃度可以使封裝在GelMA水凝膠內(nèi)的角膜緣基質(zhì)干細(xì)胞保持高的細(xì)胞活性并能鋪展開(kāi)。制備模具并通過(guò)灌注的方式制備了纖維水凝膠復(fù)合支架,。

纖維水凝膠復(fù)合支架（圖標(biāo)e）

角膜支架的性能

通過(guò)研究不同纖維間距的網(wǎng)格狀支架對(duì)纖維水凝膠復(fù)合支架理化性能的影響,，找出了最優(yōu)的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)可以使纖維水凝膠在力學(xué)性能、透光度和溶脹性方面最接近于天然的角膜組織,。

研究將角膜緣基質(zhì)干細(xì)胞接種在2D的細(xì)胞培養(yǎng)皿,，3D的GelMA水凝膠和最優(yōu)選的纖維水凝膠復(fù)合支架內(nèi)，并研究角膜緣基質(zhì)干細(xì)胞在含血清及不含血清的培養(yǎng)基中的分化及角膜基質(zhì)細(xì)胞表型的維持,。研究表明這種最優(yōu)選的纖維水凝膠的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)及無(wú)血清培養(yǎng)基可以抑制角膜基質(zhì)細(xì)胞向成纖維細(xì)胞分化,。

最后研究使用大鼠進(jìn)行角膜內(nèi)的板層移植實(shí)驗(yàn)，分別進(jìn)行了有無(wú)化學(xué)因子的3D的GelMA水凝膠和有無(wú)化學(xué)因子的最優(yōu)選的纖維水凝膠支架的移植,，對(duì)照組為自體角膜移植,。術(shù)后通過(guò)OCT，免疫熒光染色及HE染色進(jìn)行3個(gè)月的研究觀察,，發(fā)現(xiàn)相比于其他的支架,，含化學(xué)因子的最優(yōu)選的纖維水凝膠支架的移植可以最好的實(shí)現(xiàn)角膜基質(zhì)的誘導(dǎo)再生。

今年5月,，孫偉教授團(tuán)隊(duì)通過(guò)3D打印制造出了一種個(gè)性化的宮頸組織植入物,，可以對(duì)抗人類(lèi)乳頭瘤病毒（HPV）。通過(guò)在錐形聚氨酯植入物的多孔結(jié)構(gòu)中,，加載一種抗HPV蛋白,，該團(tuán)隊(duì)能夠定量控制該蛋白的釋放，并在宮頸部位附近抑制HPV的生長(zhǎng),。

3D打印的宮頸植入物，圖為清華大學(xué)的照片

HPV與宮頸癌

HPV是全球91%的宮頸癌病例的病因,。每年有46萬(wàn)個(gè)新病例,，主要的治療方法是宮頸錐體切除術(shù),，即切除一個(gè)錐體形狀的組織樣本，用于診斷,。如果有癌前細(xì)胞存在,，該方法還可以去除癌前細(xì)胞，大部分組織會(huì)在六周內(nèi)重新生長(zhǎng)出來(lái),。然而,，這種治療方法并不是神藥，因?yàn)樗赡軐?dǎo)致組織缺損,，而且往往感染復(fù)發(fā)率較高,。

3D打印的宮頸移植術(shù)

研究人員的目標(biāo)是開(kāi)發(fā)一種非破壞性的抗HPV植入物，這種植入物也可以促進(jìn)結(jié)扎部位的組織生長(zhǎng),。

首先是根據(jù)醫(yī)學(xué)影像數(shù)據(jù)設(shè)計(jì)出錐形結(jié)構(gòu),，然后選擇的材料是FDA認(rèn)證的可植入生物材料--聚氨酯，采用的3D打印技術(shù)是低溫沉積（LDM）,。與普通的FDM不同,，LDM是在零度以下的環(huán)境中進(jìn)行的，通常是在-20°C到-30°C的環(huán)境中進(jìn)行,，所以相分離是在打印結(jié)構(gòu)內(nèi)部進(jìn)行的,。結(jié)合凍干技術(shù)，可以在3D打印出的零件中獲得多孔結(jié)構(gòu),。

植入物的多孔結(jié)構(gòu),，圖片來(lái)源：清華大學(xué)

多孔性在這里很重要，因?yàn)樗梢宰屟芯咳藛T在植入物中裝載抗HPV "JB蛋白",。為了修改和測(cè)試不同的孔隙度,，研究人員在制造過(guò)程中簡(jiǎn)單地修改了溫度曲線，并實(shí)現(xiàn)了各種導(dǎo)線間距,。研究小組發(fā)現(xiàn),，孔隙度與蛋白質(zhì)負(fù)載之間呈線性負(fù)相關(guān)，但蛋白質(zhì)的釋放率隨孔隙度的增加而增加,。研究人員發(fā)現(xiàn),，該蛋白能有效地抑制HPV進(jìn)入宿主細(xì)胞，降低了HPV作為植入部位的活性,。

細(xì)胞毒性和細(xì)胞相容性試驗(yàn)也指出,，植入物能促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)和粘附，修復(fù)愈合后的組織,。在此基礎(chǔ)上,，力學(xué)測(cè)試返回的力學(xué)性能與原始宮頸組織相當(dāng)--抗壓模量為0.06-0.25兆帕。該結(jié)果有力地表明,，3D打印技術(shù)可用于修復(fù)凝固后的宮頸組織,，并抑制HPV感染的復(fù)發(fā),。

生物相容性試驗(yàn)中的成像，圖片來(lái)源：清華大學(xué)

如果你想進(jìn)一步了解生物3D打印技術(shù)的進(jìn)展,，3月,，孫偉教授及生物3D打印領(lǐng)域一眾大咖們?cè)谥诳疊iofabrication上發(fā)表文章生物3D打印路線圖（The Bioprinting Roadmap），從生物3D打印的各個(gè)層面提出目前現(xiàn)狀,、存在的問(wèn)題與未來(lái)的可能路徑,。無(wú)論您想全面了解生物3D打印，還是試圖探索本領(lǐng)域的新方向,，看這一篇就夠了,。

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