Biofabrication：載干細(xì)胞DLP打印用于角膜重建治療

來(lái)源： EngineeringForLife

在全球范圍內(nèi),，有超過(guò)500萬(wàn)人受到角膜失明和角膜緣干細(xì)胞缺陷（LSCD）的影響，這是一種常見(jiàn)的病因,。傳統(tǒng)的LSCD治療采用手術(shù)修復(fù)干預(yù)措施,，使用羊膜（AM）等來(lái)源作為基底或支架，結(jié)合角膜緣自體移植物或同種異體移植物,。這些治療方法受限于缺乏標(biāo)準(zhǔn)化的AM制備,、發(fā)生醫(yī)源性L(fǎng)SCD和免疫排斥的風(fēng)險(xiǎn)。

近期,，來(lái)自加州大學(xué)圣地亞哥分校的Shaochen Chen團(tuán)隊(duì)和加州大學(xué)洛杉磯分校的Sophie X. Deng團(tuán)隊(duì)合作使用甲基丙烯�,；�明膠（GelMA）或透明質(zhì)酸甲基丙烯酸縮水甘油酯（HAGM）基于DLP的生物打印產(chǎn)生的微型水凝膠支架可以支持封裝的原代兔LSC（rbLSC）在培養(yǎng)中的生存能力。該研究結(jié)果為干細(xì)胞療法和角膜重建的再生醫(yī)學(xué)提供了寶貴的見(jiàn)解,。相關(guān)論文“Bioprinting of Dual ECM Scaffolds Encapsulating Limbal Stem/Progenitor Cells in Active and Quiescent Statuses”發(fā)表于雜志Biofabrication上,。

如圖1所示，研究者定制的基于DLP的生物打印系統(tǒng)可以根據(jù)用戶(hù)定義的輸入設(shè)計(jì)在空間上操縱光,，從而可以對(duì)包含不同材料成分的細(xì)胞化水凝膠結(jié)構(gòu)進(jìn)行基于光聚合的精確圖案化,。使用基于DLP的生物打印技術(shù)，能夠在幾秒鐘內(nèi)制造出具有復(fù)雜圖案和微尺度分辨率的GelMA或基于HAGM的水凝膠支架,。為了測(cè)試生物相容性,，制造了基于GelMA或HAGM的生物打印支架來(lái)封裝初級(jí)rbLSC�,；钏廊旧�證實(shí),，兩種類(lèi)型的生物打印支架都能夠在培養(yǎng)7天后支持封裝的rbLSCs的生存能力。簡(jiǎn)而言之,，能夠使用基于DLP的生物打印系統(tǒng)制造封裝可行的初級(jí)rbLSC的GelMA和HAGM支架,。

圖1 封裝初級(jí)rbLSC的GelMA或HAGM支架的生物打印

如圖2所示，基于GelMA和HAGM的生物打印支架的機(jī)械測(cè)試表明打印系統(tǒng)中楊氏模量和曝光時(shí)間之間呈正線(xiàn)性相關(guān),。GelMA和HAGM支架具有相似的楊氏模量,，曝光時(shí)間設(shè)置為25秒，作為后續(xù)實(shí)驗(yàn)的主要生物打印參數(shù),。免疫熒光染色顯示PAX6在GelMA和HAGM封裝的rbLSC中表達(dá),，而增殖標(biāo)記KI67的表達(dá)僅存在于基于GelMA的支架中,。與封裝在GelMA中的相比，流式細(xì)胞術(shù)鑒定出封裝在基于HAGM的生物打印支架中的KI67陽(yáng)性rbLSC的百分比顯著降低,，而干性標(biāo)記物的陽(yáng)性比率ΔNP63在兩種支架中保持相同,。研究者還使用實(shí)時(shí)qPCR進(jìn)行了轉(zhuǎn)錄分析，以比較2D培養(yǎng)或封裝中的rbLSCs與基于GelMA或HAGM的生物打印支架,�,？偟膩�(lái)說(shuō)，這些結(jié)果證明了封裝在基于GelMA的支架中的rbLSCs的活性狀態(tài)和基于HAGM的支架中rbLSCs的靜止特性,。

圖2 封裝的初級(jí)rbLSCs在基于GelMA或HAGM的生物打印支架中顯示出不同的狀態(tài)

如圖3所示,，研究者進(jìn)一步探索了人類(lèi)LSCs中的LSC-ECM相互作用，與rbLSCs類(lèi)似,，活死染色表明,，大多數(shù)封裝的hLSCs在培養(yǎng)過(guò)程中在兩種類(lèi)型的生物打印支架中仍然可行。與rbLSCs一致,，hLSCs的聚集菌落主要存在于基于GelMA的支架中,，但在基于HAGM的支架中很少觀(guān)察到。實(shí)時(shí)qPCR顯示封裝在基于HAGM的支架中的hLSCs具有顯著更高的PAX6,、CD200和P27KIP1表達(dá),，而與二維對(duì)照和GelMA組相比，KI67的表達(dá)顯著下調(diào),。這些結(jié)果強(qiáng)化了LSCs對(duì)周?chē)鶨CM成分的不同反應(yīng)的觀(guān)察結(jié)果,，并且無(wú)論LSCs是從兔子還是人類(lèi)中分離出來(lái)的，似乎都是一致的,，這表明這對(duì)未來(lái)的臨床研究可能非常有價(jià)值,。

圖3 封裝的原代hLSCs在基于GelMA或HAGM的支架中保持活力并顯示出不同的狀態(tài)

如圖4所示，研究者首先用GelMA和HAGM與熒光微球混合打印了微尺度的“陰陽(yáng)”圖案,。在后續(xù)打印中,，用初級(jí)rbLSCs替換了熒光微球，并驗(yàn)證了雙ECM模型不同部分中封裝的rbLSCs的狀態(tài),。因此,，通過(guò)該生物打印方法，能夠制造出雙ECM“陰陽(yáng)”模型,，其單獨(dú)的ECM部分誘導(dǎo)LSC的活動(dòng)/靜止?fàn)顟B(tài),。

圖4 封裝rbLSC的雙ECM“陰陽(yáng)”模型的生物打印

綜上所述，本研究應(yīng)用基于DLP的生物打印來(lái)制造基于GelMA和HAGM的工程微型水凝膠支架,。這些支架不僅支持封裝的初級(jí)rbLSCs和hLSCs的生存能力,，而且還表現(xiàn)出差異調(diào)節(jié)。發(fā)現(xiàn)LSC顯示出ECM依賴(lài)的活動(dòng)/靜止?fàn)顟B(tài),，因?yàn)樗鼈冊(cè)诨�于GelMA的支架中積極增殖并在基于HAGM的支架中呈現(xiàn)出靜止特征,。基于這些發(fā)現(xiàn),，制造了一個(gè)包含活性和靜止LSC的生物打印雙ECM“陰陽(yáng)”模型,。總之,，這些結(jié)果說(shuō)明了一種用于疾病建模,、藥物篩選和開(kāi)發(fā)基于LSC的再生療法來(lái)治療LSCD和相關(guān)眼部疾病的創(chuàng)新工程方法。

參考文獻(xiàn)

Zhong Z, Balayan A, Tian J, Xiang Y, Hwang HH, Wu X, Deng X, Schimelman J, Sun Y, Ma C, Dos Santos A, You S, Tang M, Yao E, Shi X, Steinmetz NF, Deng SX, Chen S. Bioprinting of dual ECM scaffolds encapsulating limbal stem/progenitor cells in active and quiescent statuses. Biofabrication. 2021 Jul 30.
https://doi.org/10.1088/1758-5090/ac1992