利用3D打印技術(shù)制備用于培育肉生產(chǎn)的豬骨骼肌組織

來源: 食品科學(xué)雜志  

培育肉由體外動物細(xì)胞培養(yǎng)發(fā)展而來，采用可控的細(xì)胞增殖,、定向分化,、收集和加工,，代表了食品的未來。與傳統(tǒng)的肉類生產(chǎn)相比,，培育肉是在無菌實驗室/工廠中生產(chǎn)的,，是清潔,、安全且可持續(xù)的,。此外,，與普通肉（或植物蛋白肉）不同,，培育肉含有真正的動物蛋白,，具有廣闊的市場前景,。作為一種新興食品，培育肉在食用,、感官、安全,、營養(yǎng)和價格方面受到廣泛關(guān)注,。

培育肉生產(chǎn)包括動物細(xì)胞分離、體外細(xì)胞擴(kuò)增,、細(xì)胞定向分化,、三維（3D）培養(yǎng)、最終獲取纖維和食品加工,。這一過程的目的是用少數(shù)細(xì)胞重建牲畜肌肉的復(fù)雜結(jié)構(gòu),。然而，由于實驗室中通常使用的培養(yǎng)皿只能實現(xiàn)二維單層細(xì)胞培養(yǎng),，因此可以利用組織工程構(gòu)建使用支架材料的3D培養(yǎng)系統(tǒng),，以更好地模仿體內(nèi)的生長環(huán)境。

3D生物打印技術(shù)被廣泛應(yīng)用于組織工程領(lǐng)域,。對于培育肉生產(chǎn),，3D生物打印技術(shù)提供了一種從肌肉細(xì)胞獲得組織結(jié)構(gòu)的有效途徑。由于生物墨水?dāng)y帶細(xì)胞并支撐結(jié)構(gòu),，它們必須具有良好的機(jī)械性能和生物兼容性,，這是3D生物打印的關(guān)鍵挑戰(zhàn),。這些特性決定了3D結(jié)構(gòu)的精度和細(xì)胞的活性,。

由于水凝膠的高含水量,、物理結(jié)構(gòu)、機(jī)械性能和3D網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu),，目前是首選的生物墨水,。水凝膠還可以模仿細(xì)胞周圍的細(xì)胞外基質(zhì),，為細(xì)胞生長提供有利的環(huán)境,，并使細(xì)胞間相互作用和生化信號交換成為可能,。各種天然水凝膠材料常用于3D生物打印系統(tǒng),，也廣泛用于食品工業(yè),，如海藻酸鹽和明膠作為食品添加劑,，膠原蛋白作為外殼原料,，以及絲素蛋白用于食用包裝材料,。

海藻酸鹽是最常用的離子交聯(lián)生物墨水,，其特點是成型和機(jī)械性能好,，與鈣離子的離子固化能力強(qiáng),，生物相容性差。明膠-甲基丙烯酸酯（GelMA）是一種改性明膠,，其溶液可以用紫外線或可見光固化成膠水,；具有可打印性和可成型性的優(yōu)點，但其生物相容性和機(jī)械性能仍有待優(yōu)化,。絲素蛋白價格低廉,，具有良好的生物相容性，但機(jī)械性能較差。單一的天然凝膠材料不能完全滿足一個好的生物墨水的特性,；不同生物墨水的組合可以使它們各自的優(yōu)勢得到發(fā)揮,。

在這項研究中， 中國肉類食品綜合研究中心的李瑩瑩,、王守偉等 開發(fā)了兩種復(fù)合水凝膠生物墨水,，即離子固化的海藻酸-明膠水凝膠（AG）和光固化的GelMA-絲素蛋白水凝膠（GS），用于構(gòu)建培育肉的3D骨骼肌組織,。通過改變不同比例的水凝膠生物墨水的打印特性,，選擇了最佳的生物墨水來構(gòu)建豬骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞（PMSCs）3D培養(yǎng)系統(tǒng)，以制備能夠最好地模仿體內(nèi)肌肉狀態(tài)的肌肉組織,，從而克服了由于PMSCs在體外的貼壁生長而導(dǎo)致的培育肉中小構(gòu)件的限制,。


生物墨水的選擇和優(yōu)化
流變行為
研究了AGs 1～4和GSs 0～2的流變學(xué)特性（圖1）。隨著溫度的升高,，AG和GS的儲能模量（G'）和耗能模量（G''）不斷下降,，但G'總是高于G''，并且存在交點,，這表明溫度可以改變水凝膠狀態(tài),。本研究中凝膠溫度不同，AGs 1～4的溫度分別為27.5,、28.5,、29.5、33.0 ℃,，而GSs 0～2的溫度分別為30.0,、27.5、26.5 ℃,。在AG中,，由于明膠對溫度的敏感性，明膠溫度隨著明膠含量的增加而增加,。在GS中,，由于絲素蛋白的高溶解度，凝膠溫度隨著絲素蛋白含量的增加而降低,。

圖1 不同水凝膠配方中作為溫度函數(shù)的流變特性

每種水凝膠的黏度隨著剪切率的增加而降低,，表明所有的生物墨水都是具有剪切稀化特性的非牛頓流體，這有利于打印過程中的擠壓,。然而,，不同生物墨水的黏度不同，AG3和AG4在100 rad/s時的黏度為9～7000 Pa·s,，GS1和GS2在100 rad/s時的黏度為0.1～10 Pa·s,�,？刂拼蛴�溫度需要同時考慮到凝膠溫度和黏度，使每個生物墨水在打印開始時保持一個良好的溶液或膠體狀態(tài),。連續(xù)的擠壓力可以確保生物材料的纖維順利和連續(xù)地被擠壓出來,。此外,，在凝膠溫度下,，所有組的tanδ值都小于1，表明每種生物墨水都趨于彈性,，這種固體的特性可以增強(qiáng)打印結(jié)構(gòu)的自我支撐能力,。

機(jī)械性能
良好的機(jī)械性能使打印結(jié)構(gòu)得以維持，避免結(jié)構(gòu)變形,、斷裂和體外培養(yǎng)的退化,，這是至關(guān)重要的，并被用作評估生物墨水性能的重要指標(biāo),。本研究測定了所有打印的網(wǎng)格結(jié)構(gòu)的完整性和穩(wěn)定性,。圖2a和2b顯示了不同水凝膠在37 ℃的DMEM溶液中的打印網(wǎng)格結(jié)構(gòu)的代表性圖像。AG4結(jié)構(gòu)在第1天出現(xiàn)了裂縫,，可能是由于高明膠濃度和低海藻酸鈉比例導(dǎo)致了鈣交聯(lián)的減弱和固化不良,。AG1和AG2結(jié)構(gòu)在第3天出現(xiàn)了裂縫，但AG3在分解成幾個小塊之前保持了約14 d的形狀,。缺乏化學(xué)交聯(lián)和用明膠修飾海藻酸鹽可能導(dǎo)致這些結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性差,。GS結(jié)構(gòu)表現(xiàn)出良好的結(jié)構(gòu)完整性，因為它們的形狀至少在14 d內(nèi)保持良好,，這表明GelMA具有良好的支持性能,。

圖2 3D細(xì)胞打印結(jié)構(gòu)的機(jī)械性能

在培養(yǎng)過程中，打印材料會膨脹或收縮,。過度膨脹會導(dǎo)致結(jié)構(gòu)完整性的喪失或分層結(jié)構(gòu)的變形,，而過度收縮則會堵塞孔隙，阻礙細(xì)胞遷移和營養(yǎng)物質(zhì)運(yùn)輸,。經(jīng)過28 d的培養(yǎng),，GS2構(gòu)建物保持完好，沒有顯示出膨脹或收縮的跡象,，顯示出良好的機(jī)械性能,，并為細(xì)胞生長提供穩(wěn)定的3D交聯(lián)網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)（圖2）。

生物相容性
生物相容性是評價生物墨水模擬天然細(xì)胞能力的一個重要指標(biāo),，作為細(xì)胞外基質(zhì),，為細(xì)胞提供體內(nèi)觀察到的微環(huán)境，確保生物墨水內(nèi)的細(xì)胞在固化后能保持延伸,、增殖,、分化和連接,，實現(xiàn)相互交流。將混合有PMSCs的AG3和GS水凝膠打印出來,，在37 ℃下培養(yǎng),，觀察細(xì)胞生長。打印網(wǎng)格中的細(xì)胞密度隨著培養(yǎng)時間逐漸增加（如圖3中第1天和第3天所示）,，表明細(xì)胞生長,。然而，各種GS結(jié)構(gòu)中的細(xì)胞生長速率是不同的,。隨著絲素蛋白含量的增加,，PMSCs進(jìn)一步伸展，生長得更快,，這一結(jié)果可能是由于絲素蛋白引起的水凝膠滲透性的改善,，產(chǎn)生了更多的細(xì)胞黏附、生長和擴(kuò)散的附著點,。雖然AG3中的PMSCs一直在生長球狀體并保持細(xì)胞的活力,，但這些球狀體不能伸展。由于細(xì)胞很容易被明膠包裹并容易結(jié)塊,，它們可以存活很長時間,，但它們在支架上的附著和擴(kuò)散能力較差。

圖3 豬骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞在生長過程中的形態(tài)學(xué)變化

使用細(xì)胞活力和增殖試驗研究了GS水凝膠對細(xì)胞生存的影響,。3D生物打印7 d后進(jìn)行的活/死檢測（圖4）顯示,，GS2的總細(xì)胞數(shù)和活細(xì)胞數(shù)最高（是GS0的2倍），其次是GS1和GS0,；結(jié)果與圖3中的一致,。在7 d的培養(yǎng)后，GS2的細(xì)胞分化也比GS1和GS0快（圖5）,。GS2中的PMSCs增殖形成一個連續(xù)的片狀,，形成肌管。這些結(jié)果表明,，GS2表現(xiàn)出良好的生物相容性,，有利于細(xì)胞生長、增殖和分化,，因此可用于3D肌肉組織培養(yǎng),。

圖4 7 d齡培養(yǎng)物的活/死細(xì)胞染色結(jié)果

圖5 細(xì)胞骨架標(biāo)記物肌動蛋白（綠色）和細(xì)胞核標(biāo)記物4',6-二脒基-2-苯基吲哚（藍(lán)色）的細(xì)胞分化的代表性共聚焦3D圖像

3D生物打印支架的微孔結(jié)構(gòu)和孔隙率
3D生物打印支架的微孔結(jié)構(gòu)和孔隙率大大影響了細(xì)胞代謝。因此,，有必要構(gòu)建高孔隙率的支架,，并選擇具有良好滲透性和孔隙率的水凝膠，為細(xì)胞生長,、增殖和分化提供足夠的空間,。支架的微孔結(jié)構(gòu)和孔隙率與細(xì)胞類型和凝膠特性密切相關(guān),。

本研究中以同心圓模式研究了不同微孔尺寸對PMSCs生長的影響，在GS2中設(shè)置1.0,、1.5,、2.0和2.5 mm的線距，細(xì)胞密度為107 個/mL,�,？紤]到水凝膠的厚度，打印后的支架線距離比設(shè)定值少了約0.5 mm,。

圖6 同心圓模式的3D打印

線距為1.0 mm（實際距離為0.5 mm）時,，多層之間很容易發(fā)生堆疊,，這適合于單層印刷,。在其他線距下，隨著培養(yǎng)時間的增加,，支架上的細(xì)胞不斷向外延伸,；但只有在第5天和第10天之間觀察到7～20 μm的增加，這意味著細(xì)胞活動受到抑制,，因為細(xì)胞在3D打印后被限制在一個納米級的水凝膠網(wǎng)絡(luò)中,。先前的研究表明，孔隙率臨界增加會導(dǎo)致支架剛度下降,。由于過大的線距會影響打印結(jié)構(gòu)的自支撐穩(wěn)定性,，在本研究中，以線距1.5 mm和孔隙率1000 μm作為3D打印的標(biāo)準(zhǔn),。

與培養(yǎng)皿接觸的打印組織底層的細(xì)胞很容易黏附在壁上并迅速生長,，填充了打印組織的小孢子。因此,，對于長期的3D培養(yǎng),，必須優(yōu)化打印結(jié)構(gòu)和培養(yǎng)皿之間的接觸面積，以避免代謝通道的堵塞,。

多核肌管組成的肌肉組織的形成
多核肌管的形成和肌肉組織的成熟是培育肉制造的關(guān)鍵步驟,。由于GS2顯示出最好的生物相容性和機(jī)械性能，它被進(jìn)一步用來研究細(xì)胞增殖,、成肌分化和肌管形成,。GS2中的PMSCs表現(xiàn)出較高的細(xì)胞活力，并在14 d內(nèi)持續(xù)增殖,，尤其是從第10天到第12天（圖7b）,。細(xì)胞在支架上發(fā)展成致密狀態(tài)（圖7a），為隨后的細(xì)胞分化奠定了基礎(chǔ),。

圖7 GS2中豬骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞增殖

由于組織厚度限制了3D培養(yǎng)中的細(xì)胞生長,，本研究分別使用了厚度為2,、3、4 mm的4,、6,、8層的3D打印網(wǎng)格結(jié)構(gòu)，研究不同厚度對細(xì)胞生長和成肌分化的影響,。培養(yǎng)7 d后,，大多數(shù)PMSCs呈現(xiàn)出紡錘形結(jié)構(gòu)，盡管分化狀態(tài)是不均勻的,，在4層打印結(jié)構(gòu)中形成更多的分化細(xì)胞和肌管,。4層結(jié)構(gòu)的特點是均勻的細(xì)胞分布和初步融合的肌管，而其他兩種結(jié)構(gòu)的細(xì)胞分布是隨機(jī)的,。結(jié)果表明,，在培養(yǎng)的早期階段，層數(shù)少的組織可能表現(xiàn)出更高的營養(yǎng)輸送,、細(xì)胞增殖和分化效率,。

圖8 培養(yǎng)7 d時具有4、6,、8層打印結(jié)構(gòu)的3D共聚焦熒光圖像

培養(yǎng)16 d后,，對4、6,、8層打印結(jié)構(gòu)的免疫熒光激光共聚焦成像（圖9）表明,，打印組織中的PMSCs伸展良好，分化并逐漸融合在一起,，形成粗大的多核肌管,，在肌管和橢圓形肌管包繞的肌細(xì)胞之間形成了大量緊密貼合的細(xì)胞表面排列。此時,，4層和6層組織的細(xì)胞分化程度是相似的,，多核肌管沿著打印網(wǎng)格結(jié)構(gòu)的路線展開，因此整個網(wǎng)格結(jié)構(gòu)形成了多核肌管組織的緊湊的肌肉纖維,。細(xì)胞肌管的融合也發(fā)生在8層結(jié)構(gòu)中,，但排列緊湊程度似乎比4層和6層結(jié)構(gòu)要弱。

圖9 培養(yǎng)16 d時4,、6,、8層網(wǎng)格結(jié)構(gòu)的多核肌管的2D和3D圖像

本研究采用組織工程方法，利用3D生物打印技術(shù)為PMSCs構(gòu)建了一個3D培養(yǎng)系統(tǒng),，為細(xì)胞提供了一個完善的生長環(huán)境,，促進(jìn)了細(xì)胞高存活率、增殖,、肌管形成和成肌分化,，從而形成豬肌肉組織,。 使用GS生物墨水和3D生物打印技術(shù)生產(chǎn)的產(chǎn)品模仿了天然肌肉的結(jié)構(gòu)和功能特性； 更重要的是,，絲素蛋白很容易從養(yǎng)蠶業(yè)獲得,，成本低，大大降低了生物墨水的成本,。 因此,，該技術(shù)在生產(chǎn)動物骨骼肌組織供培育肉使用方面具有很大的潛力。