3D打印具有生物催化功能的活體材料

來源：智能材料與再生醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室

生命的組成部分主要來源于能夠形成或組裝具有高級結(jié)構(gòu)和復(fù)雜特征的生命系統(tǒng)的生物體。作為這類生物體的一個組成部分，細(xì)胞可以被招募來構(gòu)建用于能量收集,、傳感,、修復(fù)和驅(qū)動的合成生物材料或結(jié)構(gòu)。在這方面,，細(xì)胞要么構(gòu)建材料本身,，要么以特定方式調(diào)節(jié)材料的功能性能。例如,，轉(zhuǎn)基因微生物已被用于產(chǎn)生細(xì)胞外基質(zhì)材料,；這些材料已被用于多種應(yīng)用，如生成自組裝層次結(jié)構(gòu),、發(fā)現(xiàn)新型功能聚合物以及維持此類結(jié)構(gòu)以響應(yīng)環(huán)境刺激,。此外，微生物可以在生物混雜材料工程中與脫細(xì)胞成分協(xié)同工作,，從而產(chǎn)生從生物制造和生物修復(fù)到生物醫(yī)學(xué)工程的潛在應(yīng)用,。尤其是生物催化活性材料，由于其在廣泛領(lǐng)域的適用性,，最近引起了科學(xué)家們越來越多的興趣,。作為生物催化劑的微生物可以通過自然或精心設(shè)計(jì)的細(xì)胞內(nèi)化學(xué)級聯(lián)反應(yīng)將底物轉(zhuǎn)化為有價(jià)值的化學(xué)品，因此它們經(jīng)常用于發(fā)酵和污染物去除等領(lǐng)域,。盡管前景看好,，但將功能微生物與生物加工相結(jié)合的想法尚未得到充分探索。一個挑戰(zhàn)是,，整個過程需要在材料可制造性與細(xì)胞活力和功能性之間取得平衡,。此外，由于生物加工過程的動態(tài)控制仍然是該領(lǐng)域最大的挑戰(zhàn)之一,，因此迫切需要能夠創(chuàng)建具有明確3D形狀的定制活體材料的策略,，特別是在以空間方式進(jìn)行分布的同時改變其組成和功能特性。

有鑒于此,，南京工業(yè)大學(xué)材料化學(xué)工程國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室的余子夷,、陳蘇教授團(tuán)隊(duì)開發(fā)了一種具有生物催化功能的活體材料，其由雙網(wǎng)絡(luò)高分子和微生物細(xì)胞共同構(gòu)成,，并且其可用作生物墨水,，通過生物3D打印設(shè)備進(jìn)行精準(zhǔn)制造,。

相關(guān)研究工作以 “3D Printed Biocatalytic Living Materials with Dual-Network Reinforced Bioinks” 為題發(fā)表在《SMALL》期刊上，該研究得到了國家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃 “合成生物學(xué)”重點(diǎn)專項(xiàng),、國家自然科學(xué)基金,、江蘇省自然科學(xué)基金等項(xiàng)目的資助。

NO.1

為了生成可印刷油墨,，首先,，在室溫下，在 PBS 緩沖鹽水中,，將全功能化的 HA 聚合物與 CB[8] 預(yù)復(fù)合,。HA 中帶 N 端電荷的苯丙氨酸能夠與 CB[8] 以 2:1 的比例形成同質(zhì)復(fù)合物，從而產(chǎn)生具有物理交聯(lián) 3D 網(wǎng)絡(luò)和宏觀可逆觸變性的超分子凝膠（圖 1a）,。然后通過將超分子凝膠與微生物混合來獲得生物墨水,。

其次，使用載有微生物的 CB超分子水凝膠來數(shù)字打印有利于長期細(xì)胞功能的活體 3D 支架,。Bioinks 被加載到配備三軸機(jī)械機(jī)械臂的壓力控制分散盒中（圖 1b）,。為了確定打印分辨率，作者分別打印了具有 1500,、840,、580、410 和 250 μm 不同噴嘴直徑的 2D 蛇形圖案（圖S6,，支持信息）,。打印的細(xì)絲在整個圖案上具有均勻的厚度，在 250 μm 處顯示出良好的打印分辨率,。CB[8] 介導(dǎo)的超分子水凝膠適用于 3D 打印,，因?yàn)樗�在通過打印針擠出時具有剪切稀化行為（圖 1c））。打印完成后,，在紫外線輻射下啟動二次共價(jià)交聯(lián),，以提高結(jié)構(gòu)的機(jī)械性能，這有利于水凝膠的進(jìn)一步處理和長期細(xì)胞培養(yǎng)（圖 1d）,。

圖1 基于功能化的透明質(zhì)酸的雙交聯(lián)載體的設(shè)計(jì)

圖S6  噴嘴直徑分別為250微米,、410微米、580微米,、840微米和1500微米的二維蛇形圖案（從左到右）比例尺為3毫米

NO.2

圖 2c表明 CB-HA 和 CB-HA-細(xì)胞的臨界應(yīng)變約為 200%,，而 HA-細(xì)胞的損耗模量幾乎等于其儲能模量，進(jìn)一步表明添加 CB 交聯(lián)劑后機(jī)械性能的提高,。紫外線照射后,，材料的儲能模量增加了10倍，在8000Pa左右,。值得注意的是,，材料中酵母細(xì)胞的存在并未顯著改變其流變行為,，因?yàn)榫�性粘彈性區(qū)域中含有細(xì)胞的樣品的動態(tài)模量與不含細(xì)胞的樣品的動態(tài)模量接近。此外,，應(yīng)變恢復(fù)是基于軟物質(zhì)的 3D 打印應(yīng)用的關(guān)鍵特征,，因?yàn)樗�可以快速恢�?fù)機(jī)械性能，從而確保打印后的結(jié)構(gòu)保真度,。 圖2d表示了水凝膠的循環(huán)流變測試,。在較低的應(yīng)變下，水凝膠儲能模量超過損耗模量,，并在應(yīng)變急劇變化后立即以相反的方式表現(xiàn),。剪切稀化是設(shè)計(jì) 3D 可打印墨水的另一個不可或缺的因素，因?yàn)樗�允許通過打印針輕松擠出,，其中由于收縮而顯著增加了剪切應(yīng)力,。所有三個樣品在更高的剪切速率下都顯示出剪切稀化行為（圖 2e），顯示出它們在基于擠出的 3D 打印應(yīng)用中的應(yīng)用前景,。除了流變學(xué)特征外，細(xì)絲塌陷（圖S7a,，支持信息）和細(xì)絲融合（圖S7b）,，支持信息）進(jìn)行了測試以表征生物墨水的機(jī)械性能。作者還通過掃描電子顯微鏡 (SEM) 檢查了生物墨水的表面形態(tài),。然后,，作者探索了 CB生物墨水對基于擠出的 3D 打印平臺的適用性。生物墨水由氣泵擠出和控制,，并使用機(jī)械臂來操縱噴嘴的運(yùn)動以確保墨水的準(zhǔn)確沉積（圖 2f）作為演示,，制造了具有高結(jié)構(gòu)的3D晶格立方體保真度。打印后,，將 3D 結(jié)構(gòu)在 Irgacure 2959 存在的情況下暴露于紫外線下 3 分鐘,，以增強(qiáng)其機(jī)械剛度。為了證明 bioinks 的生物相容性,，嵌入的酵母細(xì)胞用活/死熒光染料染色,。如圖 2h和圖S9所示, 支持信息，在紫外線照射后,，大多數(shù)酵母細(xì)胞存活,，細(xì)胞活力高達(dá) 85%，這表明材料和交聯(lián)程序沒有顯著影響細(xì)胞活力,。SEM 圖像顯示 3D 晶格具有亞毫米孔（圖 2i-k）,，具有逐層堆疊結(jié)構(gòu)（圖 2j）。此外,，載有細(xì)胞的 3D 晶格的 SEM 圖像顯示酵母細(xì)胞（通過成像處理呈黃色）位于 HA 基質(zhì)上（圖 2k）,。

圖2 活體材料的3D打印

圖S7（a） 水凝膠絲斷裂試驗(yàn)的示意圖

圖S9 懸浮酵母細(xì)胞的熒光顯微圖像,。比例尺代表50μm

NO.3

利用酵母對葡萄糖的厭氧發(fā)酵來證明該平臺的適用性。作者設(shè)計(jì)了一種酵母提取物蛋白胨葡萄糖 (YPD) 培養(yǎng)基回收裝置（圖 3a）,，旨在最大限度地提高發(fā)酵過程中的生產(chǎn)力,。載有細(xì)胞的 3D 晶格與與對照組相同成分的大塊水凝膠一起制造（圖 3b）。作者首先測試了材料的細(xì)胞相容性,，其中酵母細(xì)胞被嵌入大塊雙交聯(lián)水凝膠中并孵育 16 小時,。結(jié)果如圖S11, 支持信息，可以注意到細(xì)胞增殖,，因?yàn)榉跤?16 小時后細(xì)胞密度增加,。為了測量這兩個生物反應(yīng)器的代謝活性，作者評估了它們在 15 小時內(nèi)的整體乙醇產(chǎn)量,，這表明 3D 晶格產(chǎn)生的乙醇明顯高于其本體對應(yīng)物,。作者進(jìn)一步評估了乙醇生產(chǎn)力的進(jìn)展和發(fā)酵過程中這兩種結(jié)構(gòu)的產(chǎn)量。圖 3c,d總結(jié)了 3D 晶格和塊狀水凝膠的乙醇生產(chǎn)率和產(chǎn)量,，按各自的權(quán)重歸一化,。兩種結(jié)構(gòu)都能夠從一開始就產(chǎn)生乙醇，而在整個發(fā)酵過程中,，晶格的乙醇產(chǎn)率高于散裝水凝膠,。作者將這種差異歸因于晶格的比表面積增加，這促進(jìn)了反應(yīng)物和產(chǎn)物與環(huán)境的交換,。整體發(fā)酵動力學(xué)顯示出一條 S 形曲線,，晶格和散裝水凝膠的乙醇生產(chǎn)率在大約 3 小時達(dá)到峰值，然后緩慢下降,，直到此后達(dá)到平臺期,。發(fā)酵15 小時，充滿細(xì)胞的晶格內(nèi)產(chǎn)生了 17.9 g·L-1 的乙醇,，大約是其塊狀對應(yīng)物的兩倍,。

圖3 生物催化活體材料的發(fā)酵性能

圖S11  在發(fā)酵和冷凍干燥一個月后，活酵母細(xì)胞在不同深度嵌入3D支架中的共焦顯微圖像,。比例尺代表50μm

NO.4

為了進(jìn)一步證明作者方法的多功能性,，作者創(chuàng)建了一個用于生物修復(fù)的細(xì)菌-微藻共培養(yǎng)生物材料系統(tǒng)。生物修復(fù)已成為比傳統(tǒng)方法更具優(yōu)勢的替代方法,，例如物化吸附,、化學(xué)氧化等昂貴且容易造成二次污染的方法。相比之下,，生物解毒更環(huán)保,，因?yàn)樗�通過生物轉(zhuǎn)化將有害的有機(jī)化學(xué)物質(zhì)代謝成無害的 CO2。在此,，作者研究了用于去除丙烯酰胺和甲基橙的芽孢桿菌-小球藻共培養(yǎng)系統(tǒng),�,？莶菅挎邨U菌能夠利用有機(jī)化學(xué)品作為碳源并將其轉(zhuǎn)化為 CO2，CO2依次被普通小球藻捕獲并通過光合作用轉(zhuǎn)化為氧氣（圖 4a）,。反之,，小球藻產(chǎn)生的氧氣被枯草芽孢桿菌捕獲進(jìn)行有氧呼吸，形成良性生態(tài)循環(huán),。然后作者將該共培養(yǎng)系統(tǒng)固定到 CB[8] 介導(dǎo)的雙網(wǎng)絡(luò)水凝膠中,，并通過增材制造構(gòu)建 3D 晶格。細(xì)菌-微藻共培養(yǎng)系統(tǒng)的3D模型如圖4b所示 . 在共聚焦顯微鏡下,，在發(fā)出強(qiáng)烈紅色熒光的葉綠素（圖4c）的存在下,，印刷的晶格看起來是綠色的 ，這表明存在大量活的小球藻細(xì)胞,。載有細(xì)胞的晶格的 SEM 圖像顯示出與含有酵母細(xì)胞的晶格相似的表面形態(tài)（圖 4d）,，這表明加載兩種類型的微生物不會破壞晶格的多孔結(jié)構(gòu)。打印和固化后,，將裝有細(xì)菌和藻類的格子支架置于合成介質(zhì)中,。如圖4e所示 ，支架膨脹了大約 1.5 倍的重量（圖S12,，支持信息）,。嵌入式共培養(yǎng)系統(tǒng)經(jīng)過 12 小時光照和 12 小時黑暗循環(huán)以實(shí)現(xiàn)高性能。檢查了細(xì)菌-微藻系統(tǒng)降解有機(jī)物質(zhì)的能力（圖 4f）,。降解動力學(xué)表明，在前 12 小時內(nèi),，大約 70% 的甲基橙被去除,，而芳酰胺則被去除了 40%。48小時后,，90%以上的有機(jī)物被降解,。

圖4 多細(xì)胞生物活體材料用于二氧化碳固定和生物修復(fù)

圖S12  負(fù)載微生物的3D結(jié)構(gòu)的溶脹率（a）負(fù)載酵母細(xì)胞，（b）負(fù)載細(xì)菌微藻

綜上,，該工作利用動態(tài)化學(xué)以及雙交聯(lián)網(wǎng)絡(luò)的方法,，成功開發(fā)了一種新的可打印的生物墨水，制造了在微尺度空間固定微生物和構(gòu)建多細(xì)胞共生的生物活體材料,，實(shí)現(xiàn)了生物催化的強(qiáng)化,。利用3D打印技術(shù)，提高了整個材料的傳質(zhì)效果,，和傳統(tǒng)的大塊材料相比,，顯著提高了材料的生物催化效果。同時,，該材料還具有可循環(huán)性,，并且在低溫或者凍干的保存條件下依然保持了良好的催化活性,。這項(xiàng)工作為探索新的生物相容性良好的可打印生物墨水提供了一個新的突破。

文章鏈接：https://doi.org/10.1002/smll.202104820