清華大學(xué)熊卓和張婷教授課題組: 功能性心肌腔室的工程化構(gòu)建最新進(jìn)展

來(lái)源：生物打印再生工程
作者：吳炳炎

在過(guò)去的幾十年里,，心臟組織工程領(lǐng)域取得了進(jìn)步,。然而,，大多數(shù)研究進(jìn)展僅限于具有簡(jiǎn)單拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)的微尺度工程化心肌組織 (ECT),，如3D條帶和心肌補(bǔ)片,。盡管微尺度ECT有利于藥物篩選應(yīng)用,，但它們?cè)谛呐K修復(fù)和心臟疾病體外建模方面的應(yīng)用十分有限,。最近，研究人員進(jìn)行了各種嘗試來(lái)構(gòu)建工程化心肌腔室 (ECP),，例如腔室,，以重現(xiàn)天然心臟的結(jié)構(gòu)復(fù)雜性。從微尺度ECT到宏觀ECP的轉(zhuǎn)變將大大加速其應(yīng)用,；然而,，研究人員面臨著拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)重建、血管化和功能成熟等障礙,。

近日,，清華大學(xué)機(jī)械工程系的熊卓和張婷教授課題組（BRE團(tuán)隊(duì)）在Biomaterials發(fā)表了一篇名為“Recent advances on bioengineering approaches for fabrication of functional engineered cardiac pumps: a review”的綜述文章,，總結(jié)了生物工程方法制造功能性工程化心肌腔室的最新進(jìn)展。文章回顧了制造ECP的生物工程方法,，總結(jié)了目前在微尺度和中觀尺度上設(shè)計(jì)血管系統(tǒng)的方法,，介紹了使心臟組織功能成熟的各種策略，并對(duì)未來(lái)提出了展望,。

背景介紹
在全球范圍內(nèi),，心血管疾病是人類(lèi)死亡的主要原因，其患病率也在隨著人口老齡化而增加,。當(dāng)向心臟供血的動(dòng)脈被阻塞時(shí),，心肌梗死與缺血性損傷有關(guān)，瘢痕組織中的纖維狀膠原蛋白和成纖維細(xì)胞取代死亡的心肌細(xì)胞(CM),，永久性降低泵血能力,，最終導(dǎo)致心力衰竭。成人心臟是人體再生率最少的器官之一,，心肌細(xì)胞每年的周轉(zhuǎn)率約為0.3-1%,。迄今為止，心臟移植仍然是治療晚期心力衰竭的金標(biāo)準(zhǔn),，而供體器官長(zhǎng)期短缺和免疫排斥一直是巨大的挑戰(zhàn),。因此，需要尋找治療缺血性心臟病的替代策略,。

干細(xì)胞療法是一種很有前景的治療方法。在過(guò)去15年中,，許多臨床實(shí)踐取得了進(jìn)展,，但仍有一些問(wèn)題需要解決，包括腫瘤發(fā)生風(fēng)險(xiǎn),、移植物免疫排斥和移植物細(xì)胞死亡等,。此外，這種方法的長(zhǎng)期治療效果存在爭(zhēng)議,，因?yàn)槟壳暗姆置渫緩�,，包括冠狀�?dòng)脈注射、靜脈注射和心肌注射,，導(dǎo)致細(xì)胞保留率/移植率低(<1%)和存活率低,。在過(guò)去十年中，研究人員開(kāi)始認(rèn)識(shí)到干細(xì)胞療法主要通過(guò)旁分泌機(jī)制來(lái)發(fā)揮作用,。因此,，使用非編碼RNA包括微RNA(miRNA)、長(zhǎng)非編碼RNA(lncRNA)和外泌體等方法吸引了越來(lái)越多的興趣,。此外,，研究人員最近報(bào)道,，使用特定的轉(zhuǎn)錄因子組合，能夠?qū)⑿募」Ｋ篮蟮鸟�傷組織直接重編程到心肌細(xì)胞中,，并在體內(nèi)和體外都得到了驗(yàn)證,。然而，盡管存在可行性且前景誘人,，但應(yīng)該指出,，這些概念仍處于起步階段，需要在臨床應(yīng)用前對(duì)安全性和有效性進(jìn)行系統(tǒng)驗(yàn)證,。

此外,，心臟組織工程也是一種治療方法。心臟組織工程的重點(diǎn)是在體外創(chuàng)造有功能的心臟組織替代物來(lái)替代或恢復(fù)受損的心肌,。除心臟修復(fù)外,，工程化心肌組織還可用于藥物篩選和體外心臟功能和疾病建模。在過(guò)去的幾十年里,，心臟組織工程領(lǐng)域有兩個(gè)截然不同的方向,。一個(gè)方向是在微尺度上發(fā)展具有最小結(jié)構(gòu)復(fù)雜性的功能性工程心肌組織(ECT)，如3D條帶和心肌補(bǔ)片,。微尺度ECT的厚度通常小于500 μm,，不需要引入血管系統(tǒng)來(lái)滿(mǎn)足其代謝需求。相對(duì)較小的體積有利于其存活和體外成熟,，此外,，微尺度ECT能夠產(chǎn)生力并對(duì)藥物做出可預(yù)測(cè)反應(yīng)。由于ECT拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)重建簡(jiǎn)單,，且具有高通量和標(biāo)準(zhǔn)化的特點(diǎn),，其可應(yīng)用于藥物篩選。

另一個(gè)方向是在宏觀尺度上開(kāi)發(fā)工程化心肌腔室(ECP),，包括工程人類(lèi)心室和完整的心臟模型,。目前，在嚙齒類(lèi)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中有治療效果的心臟心肌補(bǔ)片需要擴(kuò)大,，以滿(mǎn)足人類(lèi)移植物的要求,。更重要的是，單純擴(kuò)大心臟心肌補(bǔ)片可能不足以完全恢復(fù)受損心臟的功能,。對(duì)于先天性心臟病,，如左心室發(fā)育不良綜合征，工程心室可能是一個(gè)更好的移植選擇,。而對(duì)于終末期心力衰竭,，在未來(lái)可能需要一個(gè)工程全心來(lái)代替捐贈(zèng)的心臟。與微尺度ECT相比，宏觀ECP可作為研究心功能和疾病的更理想模型,。ECP可以評(píng)估壓力-容積指標(biāo),，并具有人類(lèi)心臟的功能，因此有望最終取代動(dòng)物模型,。

在過(guò)去的幾年里,，許多研究人員對(duì)制造ECP進(jìn)行了各種嘗試。2018年,，Parker的團(tuán)隊(duì)通過(guò)在橢圓形電紡絲支架上播種細(xì)胞,，開(kāi)發(fā)了一個(gè)類(lèi)似心室的腔室。然而,，由于固有的低細(xì)胞播種效率(通常小于107個(gè)細(xì)胞/cm3),，工程心室的壁厚被限制在100 μm左右，導(dǎo)致收縮強(qiáng)度小得多,，僅相當(dāng)于其原生心室的2%左右,。3D生物打印技術(shù)，特別是新型的嵌入式擠出生物打印技術(shù),，已成為制造工程化心肌腔室更理想的方法,。2019年，Dvir的團(tuán)隊(duì)通過(guò)在懸浮介質(zhì)中打印載有細(xì)胞的脫細(xì)胞胞外基質(zhì)生物墨水,，生成了一個(gè)全尺寸的心臟模型,。但由于體外培養(yǎng)時(shí)間不夠長(zhǎng)，該模型未能實(shí)現(xiàn)大尺度收縮功能,。最近,，基于懸浮水凝膠的自由形式可逆嵌入 (FRESH) 技術(shù)，F(xiàn)einberg團(tuán)隊(duì)產(chǎn)生了接近生理細(xì)胞密度(約3×108個(gè)細(xì)胞/cm3)和同步搏動(dòng)能力的開(kāi)放心室,，以及一個(gè)無(wú)細(xì)胞全尺寸人類(lèi)心臟模型,。同樣，Ogle的團(tuán)隊(duì)在懸浮介質(zhì)中通過(guò)3D打印產(chǎn)生封閉的心室,，其細(xì)胞密度接近于人誘導(dǎo)多能干細(xì)胞的原位增殖和分化所獲得的生理細(xì)胞密度(約3×108個(gè)細(xì)胞/cm3)。然而,，由于缺乏血管,，這些研究中工程腦室的壁厚限制在200μm左右。到目前為止,，大尺度ECP的發(fā)展仍處于起步階段,，ECP內(nèi)單個(gè)心肌細(xì)胞的成熟度仍然不足。

從微尺度ECT到宏觀ECP,，以及最終完整的心臟移植物的實(shí)現(xiàn)與幾個(gè)關(guān)鍵挑戰(zhàn)有關(guān),，包括拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)重建、血管化和功能成熟(圖1)。本文的目的是回顧這些領(lǐng)域的最新技術(shù)進(jìn)展,，并為功能性ECP的進(jìn)一步實(shí)現(xiàn)提供思路,。在文章中，首先介紹了重構(gòu)天然心臟的復(fù)雜拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)重建特征的生物工程方法,，并強(qiáng)調(diào)接近生理的細(xì)胞密度的作用,，這對(duì)其生理功能至關(guān)重要。對(duì)于厚心臟組織和ECP來(lái)說(shuō),，多尺度血管的整合是維持細(xì)胞活力所必需的,。因此，本文也討論了心臟組織的血管化策略及其在宏觀ECP中的潛在適用性,。此外,，本文回顧了目前工程化心肌組織的成熟機(jī)制，強(qiáng)調(diào)了它們促進(jìn)單個(gè)心肌細(xì)胞成熟的能力以及它們?cè)诤暧^ECP中的適用性,。最后,，本文針對(duì)相關(guān)挑戰(zhàn)、趨勢(shì)機(jī)遇,，提出了一系列重要觀點(diǎn),。

圖1 體外構(gòu)建工程化心肌腔室(ECP)的主要挑戰(zhàn)

工程化心肌腔室(ECP)的制造
在過(guò)去的幾十年里,，出現(xiàn)了多種制造技術(shù)來(lái)設(shè)計(jì)制造工程化心肌組織和工程化心肌腔室,。這些技術(shù)通常分為兩類(lèi),，即自上而下的策略和自下而上的策略,。不同的制造技術(shù)重現(xiàn)天然心臟的結(jié)構(gòu)復(fù)雜性和細(xì)胞密度的能力存在差異(圖2),。自上而下的策略包括支架接種和水凝膠澆鑄的方法。盡管支架接種方法具有構(gòu)建復(fù)雜結(jié)構(gòu)的能力,，但細(xì)胞接種密度較低(通常小于107/cm3)。水凝膠注模策略能夠?qū)崿F(xiàn)高細(xì)胞密度,，但只能形成較為簡(jiǎn)單的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)重建,�,；�于載細(xì)胞微單元模塊化組裝的自下而上策略包括自組裝、遠(yuǎn)程組裝和定向組裝方法,。其中，3D生物打印通過(guò)逐層精確定位細(xì)胞和生物材料,，已成為最有前景的工程化心肌腔室構(gòu)建方法,。展望未來(lái),，工程化全心臟的最終實(shí)現(xiàn)方案可能在于細(xì)胞自組裝和3D生物打印技術(shù)的融合,。

圖2 體外構(gòu)建心肌組織的生物工程策略。自上而下的策略包括支架接種(a)和水凝膠注模(c)；自下而上策略包括自組裝,、遠(yuǎn)程組裝和定向組裝(b)。

圖3 工程化心肌腔室(ECP)制造方法,。通過(guò)在旋轉(zhuǎn)橢圓形收集器上拉紡纖維制成納米纖維心室形支架,，接種多能干細(xì)胞分化的心肌細(xì)胞并用導(dǎo)管傳感器縫合在管道上，在施加外部壓力的生物反應(yīng)器中培養(yǎng)(a),；在灌注生物反應(yīng)器中將完整大鼠心臟再細(xì)胞化(b),；在定制的模具中鑄造類(lèi)器官并依次從模具中取出，構(gòu)建的人類(lèi)心室樣心腔(c),；通過(guò)噴墨打印構(gòu)建半心臟模型(d),；在支撐槽內(nèi)打印帶有三腳架血管和分離的左右心室的心臟模型(e)；通過(guò)FRESH技術(shù)打印的接近生理細(xì)胞密度的開(kāi)放心室(f),。

工程化心肌腔室(ECP)的血管化
天然心臟是高度血管化的器官,。分級(jí)血管系統(tǒng)向單個(gè)心肌細(xì)胞輸送必需的營(yíng)養(yǎng)和氧氣，并通過(guò)旁分泌信號(hào)促進(jìn)心肌成熟和整體收縮功能,。對(duì)于厚心臟組織的再生,，促進(jìn)營(yíng)養(yǎng)交換的體外動(dòng)態(tài)培養(yǎng)只能在有限的擴(kuò)散距離下維持細(xì)胞活力，而宿主血管系統(tǒng)生長(zhǎng)進(jìn)入工程組織的血管生成過(guò)程通常需要數(shù)天到數(shù)周時(shí)間,，無(wú)法提供及時(shí)的營(yíng)養(yǎng)供應(yīng),。因此，在移植時(shí)加入血管網(wǎng)絡(luò),，并促進(jìn)其與宿主血管系統(tǒng)的整合對(duì)于確保厚心臟組織的細(xì)胞活力和功能成熟至關(guān)重要,，ECP也是如此。

人類(lèi)心臟中的分層血管系統(tǒng)包括動(dòng)脈,、小動(dòng)脈,、靜脈、小靜脈和毛細(xì)血管,，直徑跨越幾個(gè)數(shù)量級(jí),。除內(nèi)皮內(nèi)層和基底膜外層外，微尺度毛細(xì)血管還稀疏地被周皮細(xì)胞覆蓋,，而中尺度小動(dòng)脈和大尺度動(dòng)脈則被平滑肌細(xì)胞以及彈性蛋白和膠原纖維結(jié)合,。毛細(xì)血管在大約200 μm的距離內(nèi)為實(shí)質(zhì)細(xì)胞提供有效的營(yíng)養(yǎng)和氧氣交換,，而肌肉動(dòng)脈和小動(dòng)脈控制著血液的搏動(dòng)流動(dòng)(圖4a)。到目前為止,，研究人員在工程組織中微血管和中尺度血管的形成方面分別取得了很大進(jìn)展(圖4b-f),。內(nèi)皮細(xì)胞可在載細(xì)胞基質(zhì)中自組裝形成微尺度毛細(xì)血管，然而它們往往難以在體外灌注并在體內(nèi)與宿主血管相吻合,。生物工程方法可生成數(shù)百微米至數(shù)毫米的中尺度血管,，并與宿主血管結(jié)合，然而它們不能有效地將營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)輸送到周?chē)�組織,。因此,，大尺度ECP的長(zhǎng)期生存需要在體外形成微、中尺度血管,，模擬復(fù)雜的多尺度血管,。

圖4 克服擴(kuò)散限制的血管化策略。微尺度毛細(xì)血管(b-d)和中尺度血管(e-f)的體外形成是厚心臟組織所必需的,；微尺度毛細(xì)血管的體外形成依賴(lài)于內(nèi)皮細(xì)胞(EC)的自組裝,，其由血管新生和血管形成驅(qū)動(dòng)(b)；微血管取向由拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)重建或力學(xué)信號(hào)調(diào)節(jié)(c),；通過(guò)吸引周皮細(xì)胞和提供合適的力學(xué)環(huán)境促進(jìn)微血管成熟(d),；單層血管的形成是通過(guò)在血管細(xì)胞存在時(shí)產(chǎn)生預(yù)先標(biāo)記的通道或在EC播種后形成的(e)；通過(guò)同軸打印和擴(kuò)散誘導(dǎo)凝膠化方法形成多層異質(zhì)血管(圖f),。

圖5 工程化心肌組織中微尺度,、中尺度血管構(gòu)建方法。內(nèi)皮細(xì)胞(EC)能夠自組裝成微毛細(xì)血管結(jié)構(gòu),，由內(nèi)皮細(xì)胞特異性PECAM-A(綠色)和DAPI(藍(lán)色)染色(a),；EC在VEGF梯度(紅色箭頭)下萌發(fā)成膠原支架，并用羅丹明-鬼筆環(huán)肽(黃色)和DAPI(藍(lán)色)染色,。白色和無(wú)色箭頭分別表示與莖細(xì)胞相連和分離的尖端細(xì)胞(b),；機(jī)械約束條件下纖維蛋白凝膠中微毛細(xì)管取向，內(nèi)皮細(xì)胞由紅色 hCD31標(biāo)記,，轉(zhuǎn)導(dǎo)周皮細(xì)胞由綠色熒光蛋白(GFP)標(biāo)記,，細(xì)胞核由藍(lán)色Hoescht標(biāo)記(c)；與GelMA水凝膠中的血管周?chē)��?xì)胞共培養(yǎng)促進(jìn)微毛細(xì)血管的成熟和穩(wěn)定,。其中內(nèi)皮細(xì)胞由DsRed標(biāo)記,，表達(dá)αSMA的平滑肌細(xì)胞從間充質(zhì)干細(xì)胞分化而來(lái)(d)；通過(guò)逐層組裝具有預(yù)先設(shè)計(jì)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)重建形狀的膠原水凝膠,，形成可灌注血管通道,。內(nèi)皮細(xì)胞用CD31(紅色)和DAPI(藍(lán)色)染色(e)；在3D打印的易流變性Pluronic F127模板上澆鑄載細(xì)胞水凝膠形成可灌注血管通道,，通道內(nèi)有HUVEC(紅色)襯里,，周?chē)�組織包裹有人類(lèi)新生兒真皮成纖維細(xì)胞(HNDFs,，綠色)(f)；使用載有EC的犧牲生物墨水3D打印微纖維,，通過(guò)犧牲打印的方法制造血管化心臟心肌補(bǔ)片，用CD31(綠色)和肌動(dòng)蛋白(粉紅色)染色(g),；通過(guò)犧牲打印策略形成血管通道,，并用HUVECs(綠色)灌注(h)；用DMD立體光刻法直接制造血管化組織,，HUVEC(紅色)封裝在通道中,，HepG2細(xì)胞(綠色)封裝在周?chē)�組織中(i)；利用光切除的方法在熒光素修飾的水凝膠(綠色)中生成仿生血管通道,，并用熒光微珠(紅色)灌注(j),；通過(guò)同軸打印策略形成雙層血管(圖k)。

工程化心肌腔室(ECP)的成熟
一方面,，雖然微智造技術(shù)特別是3D打印技術(shù)能夠精確控制細(xì)胞和生物材料的空間沉積,，以創(chuàng)建腔室的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)重建形狀，但工程化心肌腔室不能自動(dòng)獲得天然心臟的功能,。工程組織通常需要經(jīng)過(guò)數(shù)周或數(shù)月的體外培養(yǎng),，通過(guò)細(xì)胞黏附、組織和基質(zhì)沉積等方式完成組織形態(tài)形成和成熟,。另一方面,，多能干細(xì)胞的出現(xiàn)，包括胚胎干細(xì)胞(ESC)和誘導(dǎo)多能干細(xì)胞(iPSC),，為體外產(chǎn)生心肌細(xì)胞(CM)提供了有效的細(xì)胞來(lái)源,，并且具有臨床規(guī)模的高通量和高純度。然而,，干細(xì)胞分化的心肌細(xì)胞(PSC-CM)通常是不成熟的,，其結(jié)構(gòu)和功能特征類(lèi)似于胎兒心肌細(xì)胞(約第十六周)，細(xì)胞和組織水平上的不成熟性已經(jīng)極大地阻礙了其在心肌再生中的應(yīng)用,。例如,，PSC-CM衍生的心臟心肌補(bǔ)片由于其獨(dú)立的、異質(zhì)性的收縮活動(dòng)可能改變宿主心肌的電傳播,，從而導(dǎo)致致命的心律失常風(fēng)險(xiǎn),。迄今為止，通過(guò)模擬心臟發(fā)育過(guò)程中的體內(nèi)環(huán)境,，已經(jīng)開(kāi)發(fā)出多種策略來(lái)促進(jìn)心臟工程組織的功能成熟(圖6),。本文回顧了目前工程化心肌組織的成熟策略，并強(qiáng)調(diào)了它們?cè)诠こ袒�心肌腔室成熟中的潛在作��,。雖然目前大多數(shù)成熟策略都是通過(guò)二維培養(yǎng)模型,、微尺度的類(lèi)器官或心臟構(gòu)建物來(lái)證明的,，但這些成熟策略與血管化策略相結(jié)合，有潛力在更大尺度上應(yīng)用于工程化心肌腔室的成熟,。

圖6 模擬體內(nèi)環(huán)境的體外成熟策略,。在胎兒早期，胚胎心臟長(zhǎng)成新月體,，之后形成由心肌層和心內(nèi)膜層組成的心管,，兩者之間有果凍狀的細(xì)胞外基質(zhì)。在胎兒晚期,，心管通過(guò)折疊和旋轉(zhuǎn)成環(huán),，并在冠狀血管系統(tǒng)和傳導(dǎo)系統(tǒng)開(kāi)始發(fā)育的同時(shí)轉(zhuǎn)變?yōu)榍皇倚呐K。代謝改變,、細(xì)胞外基質(zhì)和非肌細(xì)胞相互作用以及機(jī)械和電刺激協(xié)同作用,，促進(jìn)CM從未成熟胎兒期向完全成熟成人期發(fā)育(a)；hiPSC心源性分化能夠得到成熟程度與早期胎兒CM相當(dāng)hiPSC-CM,。目前已建立了一套促進(jìn)心臟工程組織體外成熟的生物工程方法,，包括長(zhǎng)期培養(yǎng)、生化誘導(dǎo),、與非肌細(xì)胞共培養(yǎng),、細(xì)胞-基質(zhì)相互作用和生物物理刺激等(b)。

展望與總結(jié)
在過(guò)去的幾年里,，具有復(fù)雜拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)重建特性的宏觀ECP的制備策略和微尺度ECT的成熟策略取得了顯著的進(jìn)展,。隨著干細(xì)胞、生物材料和3D生物打印等技術(shù)的快速發(fā)展和融合交叉,，功能性工程化心肌腔室的體外制造取得了長(zhǎng)足的進(jìn)步,，人類(lèi)有望迎來(lái)完整的人工心臟。本篇綜述討論了功能性工程化心肌腔室的一些主要挑戰(zhàn)和重要瓶頸,，如與制造,、血管化和成熟相關(guān)的問(wèn)題。解決這些挑戰(zhàn)可以在很大程度上推進(jìn)心臟修復(fù)和心臟疾病的體外建模的技術(shù)水平,。除了這些瓶頸,，其他關(guān)鍵的挑戰(zhàn)包括PSC-CM的成本效益和宏觀擴(kuò)展、工程心肌與宿主心肌的電整合,、宿主機(jī)體的免疫排斥,、低溫保存和監(jiān)管障礙等，需要在未來(lái)的臨床轉(zhuǎn)化中加以解決,。


參考文獻(xiàn)
本文第一作者為清華大學(xué)機(jī)械系生物制造中心的博士后方永聰,，通訊作者為清華大學(xué)機(jī)械系生物制造中心的熊卓副教授、張婷副研究員,。

Fang Y, Sun W, Zhang T, Xiong Z. Recent advances on bioengineering approaches for fabrication of functional engineered cardiac pumps: A review. Biomaterials 2022;280:121298.
https://doi.org/10.1016/j.biomaterials.2021.121298